利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究

首次从木薯中分离克隆出AGPase小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应(逆转录反应,TdT加尾,巢式及降落PCR技术)的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。

甘薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基双顺反子共表达载体构建

为了研究甘薯AGPase小亚基功能,创制高淀粉甘薯新材料,本研究构建了甘薯35S-IbAGPa1-NosT-35SIbAGPa2-NosT共表达载体.实验首先通过酶切连接的方法构建出中间载体pzp-35S-NosT,然后将分离得到的IbAGPa1和IbAGPa2 2个小亚基核苷酸片段分别与pzp-35S-NosT载体进行连接,从而得到35S-IbAGPa1-NosT和35S-IbAGPa2-NosT 2个表达框.随后,将扩增的目的基因35S-IbAGPa1-NosT的全长片段与已经构建好的pzp-35S-IbAGPa2-NosT载体通过In-fusion技术进行连接反应,最终获得双顺反子共表达载体.

玉米AGPase小亚基基因的扩张分析

采用生物信息学方法分析AGPase家族基因的系统发育关系和基因结构特征,基于玉米B73参考基因组(AGPv4)新鉴定玉米AGPase小亚基编码基因,同时根据序列比对结果重新注释基因组中发生扩张的AGPS片段基因。结果表明,新鉴定并重新注释的ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4、ZmAGPS2-5基因包含1个序列高度相似的外显子,由祖先基因ZmAGPS2-2的多个外显子(无内含子)序列拼接形成。其编码蛋白的保守结构域存在不同程度的缺失,且这3个基因在染色体上的位置无共线性关系,也不相邻。因此推测,ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4和ZmAGPS2-5基因起源方式为反转录转座复制,在演化过程中丢失了部分序列后成为功能缺失的假基因。

小麦AGPase胞质型小亚基SSUI的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244 997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU I S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.