利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究

首次从木薯中分离克隆出AGPase小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应(逆转录反应,TdT加尾,巢式及降落PCR技术)的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。

玉米AGPase小亚基基因的扩张分析

采用生物信息学方法分析AGPase家族基因的系统发育关系和基因结构特征,基于玉米B73参考基因组(AGPv4)新鉴定玉米AGPase小亚基编码基因,同时根据序列比对结果重新注释基因组中发生扩张的AGPS片段基因。结果表明,新鉴定并重新注释的ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4、ZmAGPS2-5基因包含1个序列高度相似的外显子,由祖先基因ZmAGPS2-2的多个外显子(无内含子)序列拼接形成。其编码蛋白的保守结构域存在不同程度的缺失,且这3个基因在染色体上的位置无共线性关系,也不相邻。因此推测,ZmAGPS2-3、ZmAGPS2-4和ZmAGPS2-5基因起源方式为反转录转座复制,在演化过程中丢失了部分序列后成为功能缺失的假基因。

过表达NtAGPase小亚基基因提高烟叶淀粉含量和生物量

发展以非粮食作物为原料制备乙醇等生物燃料既可缓解全球能源危机,又能减低粮食作物用于生物燃料对粮食安全的威胁。烟草Nicotiana tabacum是一种生物量较高的经济作物,培育富含淀粉的新型烟草,可专用于燃料乙醇生产。文中克隆了烟草控制淀粉生物合成的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,NtAGPase)小亚基基因NtSSU,并构建了NtSSU基因植物表达载体。通过农杆菌介导叶盘转化法在烟草中超表达NtSSU基因。转基因烟草植株表型鉴定显示,过表达NtSSU基因促进烟叶淀粉富集,烟叶淀粉含量从野生型17.5%升高到41.7%。转基因烟草的生长速率和生物量也显著增加。研究结果揭示,过表达NtSSU基因能有效调动光合产物碳通量更多地进入淀粉合成途径,提高生物质产量,且未对其他农艺性状产生负效应。因此,NtSSU基因可作为优异靶标基因应用于植物代谢工程以促进营养器官中淀粉的合成积累,从而开发专用于生产燃料乙醇的新种质。

玉米AGPase胞质型小亚基ZmSSUI基因的克隆及在籽粒发育过程中的表达

利用RT-PCR方法从普通玉米浚单20中克隆出淀粉合成关键酶-腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-Glucose Pyrophosphorylase,AGPase）胞质型小亚基（cytosolic small subunit,SSUI）基因的cDNA序列,命名为ZmSSUI（GenBank登录号：GU550073）。序列分析表明,该cDNA序列长度1554 bp,包含一个完整的开放阅读框（2~1 429 bp）,长度为1 428 bp,编码476个氨基酸,克隆基因编码的氨基酸序列与其他植物SSUI氨基酸序列有较高同源性。半定量RT-PCR分析表明,在籽粒发育过程中,ZmSSUI基因的表达呈单峰状变化,与已报道的AGPase酶活性及淀粉积累速率趋势基本一致,推测其在玉米淀粉合成中发挥着重要作用。

小麦籽粒内AGPase质体型小亚基的克隆和序列分析

文章从小麦籽粒中克隆了淀粉合成关键酶AGPase的质体型小亚基(SSU Ⅱ)的cDNA序列。其中间部分与3'端序列与大麦SSU Ⅱ(Z48563)的同源性高达97%,但在5'端特异的转移肽切割位点却比Z48563缺失一段113bp序列。本文克隆的SSU Ⅱ其特异5'端序列与已报道的大麦(Z48563)、小麦(536819)、玉米(AF334960)进行多序列比对和同源性比较显示,它们的亲缘关系较远,表明这可能是一个新的SSU Ⅱ基因。另外,在检测的22个现今推广面积较大的小麦品种中,SSU Ⅱ 5'端缺失序列的现象都普遍存在。

小麦AGPase胞质型小亚基SSUI的克隆及过表达反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶AGPase胞质型小亚基(AGPase plastic small subunit,SSU I)的cDNA全长,并构建了此基因的过表达、反义表达和RNAi干扰载体.SSUI的cDNA全长为1465 bp(GenBank No.EF405961),编码域长度为1 422 bp,位于EF405961的2～1 423 bp.同源性比较结果表明:与GenBank上已报道的SSU I基因(X66080,AF244 997,Z48562)同源性达98%～99%.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的SSU I基因的过表达载体pWM101SSU I S;将该基因反向置于pBI121质粒的CaMV35S启动子之后,构建了SSU I的反义表达载体pBI121SSU I A.同时还克隆出SSU I基因的一段260 bp高保守序列,以pFGC5941质粒为基础,构建了RNAi干扰载体pFGC5941SSU I.

甘薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基双顺反子共表达载体构建

为了研究甘薯AGPase小亚基功能,创制高淀粉甘薯新材料,本研究构建了甘薯35S-IbAGPa1-NosT-35SIbAGPa2-NosT共表达载体.实验首先通过酶切连接的方法构建出中间载体pzp-35S-NosT,然后将分离得到的IbAGPa1和IbAGPa2 2个小亚基核苷酸片段分别与pzp-35S-NosT载体进行连接,从而得到35S-IbAGPa1-NosT和35S-IbAGPa2-NosT 2个表达框.随后,将扩增的目的基因35S-IbAGPa1-NosT的全长片段与已经构建好的pzp-35S-IbAGPa2-NosT载体通过In-fusion技术进行连接反应,最终获得双顺反子共表达载体.

光合细菌Chromatium vinosum可溶性氢酶小亚基基因的克隆

光合细菌 C.vinosum可溶性氢酶由 52 k Da和 2 1.5k Da两个亚基组成 .该酶大亚基 N-末端氨基酸序列为 :SRTITIEPVTRXEGHAR,小亚基 N末端氨基酸序列为 :STQPKITVATXL DG.根椐大、小亚基 N-末端氨基酸序列设计两套引物 ,Primer1:5′g AT(g/ C) g T g AT(g/ C) g T(g/ A) Cg3′和 Primer2 :5′A g C AC(C/ g) CAg CC(C/ g) AA(g/ A) ATC3′,通过 PCR扩增获得 0 .6 kb的扩增片段 .克隆并对该片段序列进行分析 ,结果表明 ,该片段包含小亚基基因的全序列 .可溶性氢酶小亚基由 179个氨基酸残基组成 ,分子量为 2 1.8k Da,含有 Ni Fe-氢酶保守的序列框 :Cxx C......Gx Cxxx G......

家蚕微粒子病原虫(Nosema bombycis)小亚基核糖体RNA全基因的克隆及其二级结构的构建

在用PCR技术扩增、克隆、测序了家蚕微粒子病原虫Nosemabombycis (镇江株 )小亚基核糖体RNA基因核心序列(5′ 端起 12 0 0bp)的基础上 ,用SSP PCR技术克隆了核心序列 3′ 端下游序列 ,从而获得了家蚕微粒子病原虫小亚基核糖体RNA基因的全序列共 12 33bp。用RnaViz、Forcon、DCSE等生物软件构建了家蚕微粒子病原虫小亚基核糖体RNA的二级结构 ,与其它微孢子虫及真核生物小亚基核糖体RNA的二级结构相比 ,该二级结构缺乏螺旋 10、E10 1、 11、 18、E2 3 n和43。

Rubisco小亚基基因片段的亚克隆及其瞬时表达载体的构建

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶位于植物叶绿体中,是绿色植物中含量最丰富的蛋白,它催化CO2固定和光呼吸作用的第一步。从含Rubisco小亚基基因片段的pGR107-rbcS质粒中亚克隆出Rubisco小亚基基因片段,将PCR产物与pGEM-T Easy载体连接,用EcoRI酶切鉴定酶切重组载体,利用低溶点胶回收大约300bp大小的Rubisco小亚基基因片段,将其回收片段与pSLJ75515瞬时表达载体连接,用EcoRI酶切鉴定,筛选出阳性重组体,即为pSLJ75515-rbcS瞬时表达载体。本实验为进一步研究Rubisco小亚基基因功能和基因沉默机制奠定了基础。

香蕉RuBPCase小亚基基因全长cDNA的克隆和分析

利用RACE和RT-PCR技术,从香蕉中克隆出编码RuBPCase小亚基的全长cDNA,并与GenBank中已经报道的其他部分香蕉rbcS基因的核苷酸和推导的氨基酸序列进行同源性分析,为进一步研究香蕉RUBPCase的功能与结构提供依据。

浙江两地产索氏桃花水母核糖体小亚基rRNA基因序列分析

采用PCR和DNA测序技术,对杭州与绍兴产桃花水母标本的核糖体小亚基rRNA基因进行了扩增与测序.经序列比对分析,杭州与绍兴产桃花水母的核糖体小亚基rRNA基因序列与已知索氏桃花水母的序列极为相似,相似度分别为99.61%和99.45%;与索氏桃花水母的遗传距离均为0.001;经分子系统树分析,杭州与绍兴产桃花水母与索氏桃花水母的分支置信度高达100%.综上分析,杭州与绍兴产桃花水母均为索氏桃花水母(Craspe-dacusta sowerbyi),该结论与其形态学分类相一致.

血吸虫种株间18S小亚基单位核糖体核酸基因的同源性及其PCR法检测单个尾蚴的敏感性

目的探索日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸基因(18S-rRNA)序列的同源性及采用该基因建立PCR法检测水体中低密度血吸虫尾蚴的可能性。方法提取日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株及曼氏血吸虫基因组DNA,采用PCR方法检测上述基因组中同一目的DNA片段,比较其同源性;分别以经沸水加热处理、氨水处理及NaOH、HCl、乙醇沉淀处理和未经处理的单个尾蚴标本为模板,采用PCR法扩增,比较对单个尾蚴的检出率。结果以日本血吸虫中国大陆株、菲律宾株和曼氏血吸虫基因组DNA为模板,均能扩增出长度为469bp的DNA片段。经氨水处理和NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的单个尾蚴标本,PCR方法均能扩增到目的基因。在未经处理或沸水加热处理的单个尾蚴标本中,仅有50%标本能扩增到目的基因。结论血吸虫不同种株间18S-rRNA基因具有广泛同源性。经氨水处理或NaOH、HCl、乙醇沉淀法处理的标本,采用PCR法对低密度尾蚴的检出率高于未经处理或经沸水加热处理的标本。

水稻线粒体ATP合成酶小亚基基因的鉴定及解析

本研究把碳酸盐 (NaHCO3、Na2 CO3)对植物造成的逆境称为“碳酸盐逆境” (Carbonatestress)。从水稻根cDNA文库中筛选出一些与碳酸盐逆境相关的基因 ,水稻线粒体ATP合成酶 6kDa亚基基因 (简称 :RMtATP6基因 )为其中之一。该基因编码的氨基酸序列与Jansch等人 (1996 )从马铃薯(Solanumtuberosum )线粒体中纯化的线粒体ATP合成酶 6kDa亚基氨基酸序列 (F1F0 ATP合成酶的F0部分 )具有同源性 ,但是这个小蛋白的功能尚不清楚 ,其基因也没有被鉴定。本研究克隆了这个基因(Accessionnumber :AB0 5 5 0 76 ) ,并解析了在碳酸盐逆境胁迫下它的表达特性。RMtATP6基因编码的蛋白预测分子量为 6 5 78kDa ,预测的细胞内存在位置为线粒体膜间间隙 ,结果预示了RMtATP6基因编码的蛋白为水稻线粒体ATP合成酶 6kDa亚基基因。Southern杂交结果表明RMtATP6基因是水稻核基因组中的一个单拷贝基因。通过对RMtATP6基因在植物中的表达特性及在碳酸盐逆境下在酵母中的功能解析 ,表明了该基因与碳酸盐逆境有关。

几种水稻Rubis CO小亚基基因在大肠杆菌中表达方法的比较与产物的纯化

本文采用常规IB液体培养基37℃培养；增加0．66MM甜菜碱，0．33M山梨醇＋0．33M甜菜碱，0．66MM山梨醇，25℃培养于常规LB液体培养基培养以及更换温敏表达载体PBV200等三种方法，比较RubisCO小亚基基因在大肠杆菌中表达。结果表明，采用降低温度和增加培养介质的方法，目的基因以可溶性蛋白形成表达，且表达量与常远规LB培养基表达量相同；而以温敏表达载体PBV200质粒，表达总量增加且培养周期大大缩短。

胖尾刺虫(纤毛门,旋毛纲,下毛目)16s小亚基单位核糖体RNA基因的序列测定及其系统地位初探

对分离自青岛沿岸的下毛目纤毛虫 胖尾刺虫 (Uronychiatransfuga)的 16s小亚基单位核糖体RNA(16s likeSmallSubunitrRNA)基因进行了序列测定 ,通过与目内其它相近属多种纤毛虫的比较分析 ,认为游仆虫属 (Euplotes)首先从下毛目中分离出来 ,其次是属刺虫属和双眉虫属 (Diophrys) ,其间邻近的遗传距离共同构成了下毛目内最为进化的类群 游仆亚目 (Euplotina)。同时 ,序列分析也支持该目其它三个亚目的划分 :散毛亚目 (Sporadortrichina) ,排毛亚目 (Stichotrichina)和尾柱亚目 (Urostylina)。这与形态学资料是吻合的。

水稻RuBPCase小亚基基因(rbcS)全长cDNA的克隆和分析

根据国际核酸数据库中不同植物的Ru BPCase小亚基基因(rbc S)保守序列设计PCR引物,首先扩增出约35 0 bp的c DNA短片段,以此作为分子杂交探针对构建的水稻c DNA文库进行杂交筛选,同时结合PCR分析确定阳性克隆中c DNA片段的大小,选取插入的c DNA片段最长的阳性克隆进行测序分析验证,从而克隆了水稻中编码Ru BPCase小亚基的全长c DNA(Gen Bank登记号:AY4 4 5 6 2 7) .该c DNA片段从第5 2 bp开始至5 79bp含有编码175个氨基酸的开放阅读框(ORF,Gen Bank登记号:AAR192 6 8.1)和一个终止密码子.AY 4 4 5 6 2 7在3′端有一个长2 6 4 bp的非编码区,而在3′末段有poly(T) 1 7.经Compute p I /Mw软件预测,AAR192 6 8.1的等电点p I和分子量Mw 分别为9.0 3和196 30 .6 6 Da.通过与国际核酸和蛋白质数据库的blast比较分析,AY4 4 5 6 2 7序列与Gen Bank登记号D0 0 6 4 4 .1(水稻rbc S)、U 4 3493.1(大麦rbc S)、AF10 4 2 5 0 .1(燕麦rbc S)和M374 77.1(小麦rbc S)的序列相似性分别为99% (6 5 0 /6 5 5 )、84 % (436 /5 15 )、84 % (42 7/5 0 6 )和84 % (386 /4 5 6 ) .而AAR192 6 8.1氨基酸序列与Gen Bank登记号P185 6 6 (水稻rbc S)、AAF0 794 7.1(燕麦rbc S)、BAA35 16 2 .1(大麦rbc S)和BAB19812 .1(小麦rbc S)的氨基酸序列相似性分别为98% (173/175 )、84 % (14 3/16 9)、84 % (14 0 /16 6 )和83% (14 4 /173) .生物信息学的分析还表明rbc S基因不仅在水稻不同品种基因型之间非常保守,而且在水稻、小麦、大麦和燕麦等禾本科不同物种之间也高度同源.

利用核糖体DNA限制性酶切谱(ARDRA)分子技术和小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列分析对五种双眉虫(原生动物,纤毛门,游仆目)种内及种间关系的探讨

从12种限制性内切酶中筛选出6种可获得种间多样性的内切酶:Alu Ⅰ,Taq Ⅰ,Hae Ⅲ,Hinf Ⅰ,Msp Ⅰ,Xba Ⅰ,对广义双眉虫Diophrys-complex5个种(伪寡毛双眉虫Diophrys apoligothrix、悬游双眉虫D.appendiculata、盾圆双眉虫D.scutum、秀丽拟双眉虫Paradiophrys irmgard、针毛类双眉虫Diophryopsis hystrix)共7个种群的核糖体基因(18S小亚基、部分23S大亚基及其内转录间隔区域)进行多位点酶切。结果显示,种间差异明显大于种内差异。利用RAPDistance1.04软件构建的邻接树表明,盾圆双眉虫的3个种群表现出高度的同源性;3个近缘属(双眉虫属、拟双眉虫属、类双眉虫属)可以被明确区分,并支持类双眉虫属与拟双眉虫属的独立性。从GenBank/EMBL数据库中获得广义双眉虫及相近种的小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列,利用邻接法(NJ),贝叶斯法(Bayesian)和最大简约法(MP)构建的系统发生树具有基本一致的拓扑结构,结果显示:狭义双眉虫属Diophrys为单源发生系,并与类双眉虫属Diophryopsis组成姐妹群;尽管拟双眉虫属Paradiophrys具有广义双眉虫典型的形态学特征,但与尾刺虫属Uronychia有着较近的亲缘关系。本工作同时表明,核糖体DNA限制性酶切(ARDRA)技术可靠地区分纤毛虫的形态相似种,并在双眉虫属间水平的系统关系推定中存在一定的适用性。

41株戈登菌的系统发育学分析及其基因组功能的挖掘

目的探讨41株戈登菌的系统发育学及其基因组中含碳水化合物活性酶、次级代谢产物生物合成基因簇的种类及多样性。方法以公开发表的41株戈登菌全基因组数据为研究对象,利用原核生物泛基因组学分析的自动化软件对泛基因组特征进行分析,结合直系同源蛋白分组对数据库、碳水化合物活性酶数据库和基因组次级代谢产物分析工具对基因组进行预测;提取19株戈登菌基因组DNA,采用16S小亚基核糖体RNA(16S rRNA)通用引物进行PCR扩增,并构建系统发育树。结果戈登菌基因组平均大小为4941636.42 bp,预测的基因数均数4370.46,G+C平均含量为67.25%,蛋白质编码区平均为4445.60;平均核苷酸多态性、DNA-DNA杂交值和16S rRNA基因序列分析表明戈登菌分类地位明确;戈登菌具有开放型泛基因组,核心基因组基因数目会稳定在1036个左右;所有菌株基因序列中含有丰富的糖基转移酶和糖苷水解酶;聚酮合酶、非核糖体肽合成酶和萜烯类生物合成基因簇在戈登菌属中占比较高,且土壤来源的菌株含生物合成基因簇最长。结论戈登菌基因组具有多样性,含丰富的碳水化合物活性酶,能产生多种抗菌和抗肿瘤的次级代谢产物。

非洲鸵鸟源芽囊原虫基因型鉴定及分析

芽囊原虫是一种呈世界性分布的常见机会致病性原虫,为鉴定云南某非洲鸵鸟养殖专业合作社芽囊原虫感染情况及其基因型,对采集的90份鸵鸟粪便样品,通过套式PCR扩增芽囊原虫SSU rRNA基因。结果发现,62份样本为阳性,芽囊原虫感染率为68.89%(62/90);其中,90日龄感染率最高,为86.36%(19/22),60日龄感染率最低,为6.25%(20/32),但不同日龄鸵鸟芽囊原虫的感染率差异不显著(P>0.05,χ^(2)=6.67,df=3);基于SSU rRNA基因的序列分析,鉴定出ST5、ST7及ST20共3种芽囊原虫亚型,ST5为优势亚型。其中,ST5、ST7属人兽共患亚型。研究结果丰富了云南地区养殖非洲鸵鸟感染芽囊原虫的情况背景及基因分型的数据,为芽囊原虫的防控工作提供了参考。