AGS3蛋白与G蛋白信号转导

AGS3蛋白是影响受体到G蛋白的信号转导或直接影响非受体依赖型G蛋白激活的蛋白质之一。AGS3蛋白在脑、睾丸、肝脏、肾脏、心脏、胰腺及PC-12细胞中普遍分布。它不仅具有不依赖受体的Gβγ信号转导激活物的作用,也能作为二磷酸鸟苷(GDP)的解离抑制剂,并负向调节G蛋白偶联受体对G蛋白的激活。AGS1、AGS2、AGS4是AGS家族的其它几个成员,能选择性激活不同类型的G蛋白。LGN和PINS蛋白是AGS3的同系物。AGS3蛋白与信号转导的关系是目前研究的热点之一。

AGS3蛋白及其与成瘾的关系

作为G蛋白信号传递激活因子(activators of G protein signaling,AGS)之一的AGS3蛋白在大鼠脑组织、睾丸、肝脏、肾脏、心脏和胰腺组织中有不等量的分布,并且有AGS1、AGS2、AGS4、AGS8等家族成员。AGS3既有不依赖受体的Gβγ亚基信号传递激活因子的作用,也有二磷酸鸟苷解离抑制因子的作用。研究发现,慢性给予可卡因的大鼠长期戒断后,AGS3在大脑内的表达持续增加;而且还发现,AGS3与可卡因的复吸有关,它可能是引起阿片类药物成瘾复发的关键物质。

饲料中添加蛋白酶AG对鲤鱼鱼种生长和蛋白质消化酶活性的影响

通过2个试验研究了饲料中添加蛋白酶AG对鲤鱼生长和前肠蛋白质消化酶活性的影响。试验Ⅰ选用540尾均重11.7g的鲤鱼,随机均分为6组,随机选取3组分别饲喂鱼粉含量为10%、15%、20%的3种等蛋白基础饲料,另外3组分别饲喂添加有175mg/kg蛋白酶AG的以上3种饲料,试验期60d。试验Ⅱ选取120尾均重48.7g的鲤鱼,随机分为2组,一组饲喂鱼粉含量6%的基础饲料为对照组,另外一组饲喂添加175mg/kg蛋白酶AG的基础饲料为试验组,试验期为30d。试验Ⅰ结果表明:摄食10%鱼粉饲料和20%鱼粉+175mg/kg蛋白酶AG饲料的鲤鱼分别具有最低和最高的增重率;在10%鱼粉饲料中添加蛋白酶AG显著提高了鱼体增重率(P<0.05),但在15%、20%鱼粉饲料中添加蛋白酶AG,对鱼体增重率没有显著影响。试验Ⅱ结果表明:相比于对照组,试验组鲤鱼增重率提高了6.4%(P<0.05),饲料系数降低了5.4%(P<0.05)。试验Ⅰ和试验Ⅱ中,添加蛋白酶AG对鱼体肌肉水分、粗脂肪、粗蛋白质含量均无显著影响(P>0.05);对消化酶活性的测定表明,在鱼粉含量为10%、6%的基础饲料中添加蛋白酶AG,可显著提高前肠组织蛋白酶活性和食糜蛋白酶活性(P<0.05),但在鱼粉含量为15%、20%的基础饲料中添加蛋白酶AG,对前肠组织蛋白酶活性和食糜蛋白酶活性没有影响。综上所述,在鱼粉含量较低的饲料中添加蛋白酶AG,可提高鲤鱼消化道蛋白酶活性,改善生长性能。

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的 研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法 用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论 Ag85

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达 ,获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法 应用PCR技术扩增结核分支杆菌H3 7RvAg85BDNA序列 ;以质粒pET2 4b为表达载体 ,构建Ag85B重组质粒 ,然后转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;以IPTG诱导转化子 ,通过SDS -PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平 ,采用Novagen公司生产的His .Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果 重组质粒pET2 4b -Ag85B测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL2 1(DE3 )细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。纯化后的rAg85B样品经SDS -PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 95 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 10mg左右纯化的重组蛋白。结论 pET2 4b -Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白 。

结核分枝杆菌重组Ag85A蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的 :结核分枝杆菌重组Ag85A抗原诱发豚鼠迟发型超敏 (DTH)反应。Ag85A剂量、观察时间对DTH的影响。方法 :常规皮肤实验法 :灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠 ,皮肤试验以生理盐水为阴性对照 ,5IUPPD标准品为阳性对照 ,0 .1、0 .2、0 .4、0 .6、0 .8及 1.0 μg重组抗原分别于背部皮内注射 ,注射后 2 4、4 8及 72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。皮肤试验轮圈法 :生理盐水、5IUPPD及 0 .4、0 .6、0 .8、1.0 μgAg85A抗原 ,以轮圈法注射于同一只豚鼠背部一侧 ,每批 6只 ,共 3批。于注射后 2 4、4 8、72h分别测量红肿或硬结反应横、纵直径 (mm) ,取两者的平均值。结果 :常规皮肤试验 0 .1、0 .2 μg重组Ag85A抗原诱发DTH的平均直径与PPD相比有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,而 0 .4、0 .6、0 .8、1.0重组Ag85A抗原诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比 ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,2 4h平均直径显著高于 4 8h平均直径 (P <0 .0 5 ) ,2 4h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后结果与常规皮肤试验结果一致。结论

分支杆菌Ag85B蛋白对小鼠膀胱癌抑癌效应的研究

目的:探讨分支杆菌Ag85B蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应。方法:采用T739 可移植性膀胱癌模型,于移植瘤处局部注射分支杆菌Ag85B蛋白,并用卡介苗(BCG)和生理盐水(NS)作对照,观察治疗后各组的肿瘤重量和存活期。结果:分支杆菌Ag85B蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤重(4.12±0.85) g,显著低于NS组(7.01±1.18) g(P<0.01),与BCG组(3.85±1.18) g比较差异无统计学意义(P>0.05),抑瘤率为41.23%;分支杆菌Ag85B蛋白治疗组小鼠存活天数为(28.75±2.71) d,显著长于NS组(23.50±2.45) d(P<0.05),与BCG组的(29.63±3.25) d比较差异无统计学意义(P>0.05),存活延长率为22.34%。结论:分支杆菌Ag85B蛋白对小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长膀胱癌荷瘤鼠的生存期。

结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定Ag85A重组蛋白的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,Ag85A重组蛋白(10μΜ)能刺激全部12例HL-A*0201阳性(A2+)结核菌素阳性(PPD+)健康个体的PBMC发生增殖(平均SI为56.2±3.6);增殖反应明显高于PPD(平均SI为13.7±3.5)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在Ag85A重组蛋白诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μΜ)的T2细胞作为靶细胞,Ag85A重组蛋白诱导的CTL作为效应细胞,Ag85A重组蛋白能诱导全部的12例A2+PPD(+)健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(85.2±8.5%),显著高于PPD〔(平均为(21.6±1.7%)〕(P<0.01)诱导的CTL杀伤活性。结论本研究得到的重组优化Ag85A蛋白具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的结核疫苗打下了基础。

Fc段受体结合蛋白(SPA-SPG)基因克隆表达及其在IgG纯化中的应用

利用生物信息学 ,遴选编码SPA及SPG蛋白的基因 ,进行密码子优化 ,将目的基因分割成互为重叠的小片段寡聚核苷酸链 ,采用一步升温后T4DNA连接酶连接的方法 ,合成了编码SPA及SPG蛋白的融合基因 .将其克隆到pSK质粒进行扩增 ,经测序、修正后再克隆到表达载体 ,高效表达了带His6的融合蛋白———蛋白AG .将蛋白AG共价结合到表面带羧基的磁粒上 ,形成蛋白AG磁粒复合物 ,用此复合物可在 1h内从大鼠、小鼠、人、猕猴、马、羊及猪等常用实验动物血清中纯化IgG .

Ag85B核酸疫苗的免疫原性和保护性研究

扩增结核分枝杆菌的Ag85B基因并克隆于真核表达载体 pJW4 30 4 ,转染COS - 7细胞后 ,Westernblot检测表明该基因在细胞内得到了正确表达。用该质粒免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,免疫三次后 ,用纯化的重组蛋白Ag85B检测小鼠血清中的抗体 ,抗体滴度达到 1:10 2 4 0 0 ,(γ -干扰素测定表明 ,免疫动物的干扰素含量达到 116 0 3± 10 4 pg /ml。实验结果说明Ag85B核酸疫苗在实验动物体内引起了较强的免疫应答。三次免疫后经静脉强毒攻击 ,免疫组小鼠肺脏和脾脏的细菌数比对照空载体组分别减少了 1 5和 15倍以上。本研究表明 ,该核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞和体液免疫应答并获得较高的保护效率。

卡介苗Ag85B对小鼠膀胱癌治疗作用及机制的研究

目的探讨卡介苗(BCG)Ag85B蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应及免疫机制。方法采用T739小鼠皮下膀胱癌模型,肿瘤局部皮下注射BCG Ag85B蛋白,并用BCG和生理盐水作对照,观察各组的肿瘤重量和存活期,利用ELISA方法检测各组的3种主要细胞因子的水平,电镜和光镜观察各组肿瘤细胞的坏死和凋亡情况,利用流式细胞技术检测各组肿瘤细胞凋亡和细胞增殖周期。结果BCG Ag85B组小鼠肿瘤瘤重显著低于其它两组,其差异有统计学意义(P<0.05),该组小鼠存活天数显著长于其它2组,P<0.05;该组小鼠血清中白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的水平明显高于其它2组,P<0.05;电镜和光镜下观察Ag85B组坏死明显增加。细胞增殖指数下降,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论BCG Ag85B蛋白对T739小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长荷瘤鼠的生存期,不论从细胞因子水平和光镜与电镜观察坏死和凋亡情况,还是从细胞凋亡和增殖情况来看Ag85B蛋白均优于卡介苗。

MTB分泌蛋白抗原85B-早期分泌靶抗原6融合蛋白对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

目的 研究MTB分泌蛋白抗原85B（Ag85B）-早期分泌靶抗原6（ESAT6）融合蛋白在结核性胸膜炎辅助诊断中的价值。方法 研究对象为2014年1月至2015年1月于河北省胸科医院住院的结核性胸膜炎（结核组）患者45例,非结核性胸膜炎（非结核组）患者26例,以及体检健康人群（健康组）25名。应用流式细胞仪分别检测结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后结核组、非结核组外周血、胸腔积液及健康组外周血中γ干扰素（IFN-γ）的含量,采用免疫组织化学染色法检测结核组与非结核组患者组织（通过手术或穿刺活检获得的胸膜组织）中CD4 ＋和CD8 ＋细胞的表达水平。采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,数据符合正态分布的组间比较采用t检验,以P〈0.05为差异有统计学意义。 结果 MTB Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激前后,结核组外周血中IFN-γ的含量分别为（42.63±10.51）pg/ml和（401.90±72.54）pg/ml;非结核组分别为（38.97±7.08）pg/ml和（40.04±6.80）pg/ml;健康组分别为（39.61±7.28）pg/ml和（39.86±6.97）pg/ml。结核组胸腔积液中IFN-γ的含量分别为（411.91±41.56）pg/ml和（1342.67±167.96）pg/ml;非结核组分别为（47.99±11.49）pg/ml和（48.76±11.25）pg/ml。刺激前结核组胸腔积液中IFN-γ的含量明显高于非结核组,两组比较差异有统计学意义（t=55.194,P=0.000）;刺激后结核组外周血单个核细胞产生的IFN-γ含量相对于刺激前及刺激后的其他两组比较,差异均有统计学意义（t=32.879、33.211和33.204,P值均为0.000）;刺激后结核组与刺激前及非结核组刺激前后胸腔积液中IFN-γ的含量比较,差异均具有统计学意义（t=36.085、51.478和51.499,P值均为0.000）。免疫组织化学染色结果显示结核组与非结核组患者胸膜组织中的CD4 ＋和CD8 ＋积累光密度值（结核组：16349.91±2376.36和10525.77±1164.86;非结核组：1853.64±670.40和1327.15±175.55）差异均具有统计学意义（t=14.381和19.127,P值均为0.000）。 结论 结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白刺激外周血和胸腔积液后均明显提高结核特异性IFN-γ的含量,对结核性胸膜炎的辅助诊断有较高的临床应用价值。

重组结核分枝杆菌Ag85b蛋白原液纯度反向高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立检测重组结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85b蛋白原液纯度的反向高效液相色谱法,并进行验证。方法 设计4因素3水平正交试验,将面积、拖尾因子、峰面积、峰面积RSD作为评价指标进行分析,摸索最适检测条件,并依据《中国药典》四部(2020版)9101药品质量标准分析方法验证指导原则进行专属性、线性范围、精密度、耐用性等验证。结果 当检测条件为有机相洗脱比例30%~95%、检测温度35℃、进样量3μg、95%有机相洗脱时间15 min时,各评价指标结果均较好,在该检测条件下线性相关系数(R2)为0.998 5,线性范围为1.8~4.2μg;重复性RSD为0.01%;中间精密度RSD为0.16%;在柱温与流速细微变动下均具有良好的耐用性。结论 建立了重组MTBAg85b蛋白原液纯度检测的反向高效液相色谱法,该方法专属性强,精密度、耐用性好,可用于重组MTBAg85b蛋白原液质量控制。

Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫原性的影响

目的 探究Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响。方法 将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)_(3)、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(OH)_(3)和CpG组成的复合佐剂[Al(OH)_(3)+CpG]配伍,经皮下免疫BALB/c小鼠,初免后28 d加强免疫1次,分别于初免后14、42和56 d采集免疫血清,采用ELISA检测血清中Ag85B特异性IgG、lgG1、IgG2a和IgG2b水平;初免后42 d,每组取4只小鼠无菌分离脾淋巴细胞,利用酶联免疫斑点检测各组细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量,采用流式细胞术检测各组细胞中CD4^(+)T和CD8^(+)T淋巴细胞的比例。结果 1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫后均诱导了高水平的Ag85B特异性IgG,免疫效果优于该蛋白与2种佐剂单独配伍组。1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫血清中IgG亚型为IgG1、IgG2a和IgG2b混合型,其中IgG2a和IgG2b水平均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.001)。酶联免疫斑点检测显示,4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的脾淋巴细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.05);流式细胞术检测显示,1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的T淋巴细胞中CD4^(+)T淋巴细胞的占比均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组。结论 Al(OH)_(3)和CpG联合使用可能协同增强Ag85B重组蛋白的免疫原性。

表达Ag85基因重组卡介苗的构建

为研发一种更安全、有效的结核病疫苗,用于预防并清除结核病,本试验构建4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,参考pMV261载体序列和Tuberculist上登录的H37Rv序列设计引物,通过PCR扩增和无缝克隆技术构建含Ag 85基因片段的重组pMV261质粒。分别对重组质粒进行PCR、双酶切鉴定后,通过电击转化转染到卡介苗感受态细胞中,利用Kan耐药基因筛选获得重组卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鉴定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表达,再对构建成功的重组卡介苗进行培养,用于后续试验。PCR扩增结果表明,构建的重组卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分别为1447、1402、1453和1330 bp,与预期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting结果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗细胞内成功表达。本试验利用基因工程技术成功获得4株分别表达Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重组卡介苗,将其分别命名为rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C、rBCG/Ag85D。本研究可为进一步将其他抗原基因插入卡介苗细胞构建重组疫苗及疫苗研究提供材料。

稳定表达Ag85A蛋白细胞系的建立

目的建立稳定表达Ag85A蛋白的K562真核细胞系,为进一步开展以阳离子脂质体为转运载体的口服疫苗的免疫原性研究奠定基础。方法将已构建的重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A包裹阳离子脂质体LipofectamineTM 2000后,转染真核细胞K562,SDS-PAGE和Western blot分析重组Ag85A蛋白的表达。用G418筛选稳定表达Ag85A蛋白的细胞株,流式细胞术和间接免疫荧光技术检测Ag85A蛋白的表达及定位。结果重组质粒pCDNA3.1+/Ag85A转染K562细胞时,与脂质体的最适比例为2μg:2μl;转染细胞表达的Ag85A蛋白相对分子质量约为32000,且具有良好的反应原性。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞有42.37%的细胞显示FITC标记,且细胞胞浆中及细胞膜上均有Ag85A蛋白的表达。结论已获得稳定表达Ag85A蛋白的K562细胞系,可用于Ag85A蛋白的大量制备及抗体方面的研究。

实时定量qPCR检测耐异烟肼结核分枝杆菌Ag85B和38ku蛋白mRNA表达水平

目的运用实时定量qPCR(quantitative real-ti me PCR)检测结核分支杆菌耐异烟肼菌株和敏感株Ag85B和38 ku蛋白编码基因(fbpB、psts1)的表达水平,分析结核分支杆菌耐异烟肼株和敏感株的蛋白抗原在转录水平的差异性。方法根据GenBank提供的序列,设计目的基因fbpB、psts1及内参基因Sigа的特异引物,将fbpB、psts1及Sigа扩增片段克隆入载体pMD18-Tsi mple,重组质粒经纯化及倍比稀释,应用实时定量PCR检测22株耐异烟肼菌株及25株敏感菌株(含H37Rv标准株)中fbpB、psts1的表达水平。结果耐异烟肼菌株的fbpB表达水平为0.65±0.22,敏感菌株fbpB表达水平为0.36±0.13,差异有统计学意义(t=5.683,P<0.01);耐异烟肼菌株的psts表达水平为13.63±4.16,敏感菌株psts1表达水平为9.86±2.79,差异有统计学意义(t=3.869,P<0.01)。结论应用实时定量PCR检测耐异烟肼菌株的fbpB、psts1的表达水平显著高于敏感菌株,为耐药结核的实验室诊断提供分子标识。

结核分枝杆菌Ag85B蛋白的重组及表达

目的对结核分枝杆菌Ag85B蛋白进行重组表达,初步评价其免疫反应性。方法用PCR方法得到Ag85B蛋白的编码基因,构建重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG诱导表达,得到高效稳定的表达株,并用蛋白免疫印迹方法检测免疫反应性。结果获得了高效稳定的重组Ag85B的表达株,并且重组Ag85B有较好的免疫反应性。结论重组Ag85B有较好的免疫反应性,为结核病快速诊断研究及新疫苗研究提供了基础。