不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排毒规律研究

本研究旨在研究不同免疫抗体水平下H9亚型AIV的排毒规律。选取SPF鸡进行H9N2灭活疫苗免疫,根据HI效价将鸡群分成高、中、低三组,攻毒后分析其排毒差异。结果发现:抗体水平为9.44 log2时,个别鸡只仍会感染排毒,且抗体水平越低,感染排毒鸡只数量越多;当抗体水平达到11 log2时,鸡群不再排毒。

禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的研制和初步应用

目的:获得特异针对禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体。方法:以H9N2亚型病毒制成疫苗免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,取细胞上清用HI筛选。结果:共获得9株稳定分泌针对血凝素蛋白抗体的杂交瘤细胞;经广谱性和特异性鉴定,所有单抗株均能与所有检测的82株不同年代不同地方不同禽源H9亚型流感病毒大部分分离株反应,且所有单抗株均不与非AⅣ-H9病毒反应,而其中一株(8E6)能与所有检测的H9亚型病毒株反应。进行Western blot分析显示, 其中8株单抗能与AⅣ的Mr为75 000处反应,表明是针对AⅣ H9 HA的单抗。结论:本试验获得9株广谱性特异性很好的单抗,特别是8E6株;这些单抗株为以后作病毒抗原性位点分析、临床检测和流行病学调查提供了良好试剂。

重组杆状病毒表达H9亚型禽流感HA基因的研究

为研究通过体外表达的方式获得具有生物学活性的禽流感HA蛋白的方法,根据GenBank公布的禽流感H9亚型的基因序列设计引物,扩增出HA基因全长片段,将扩增片段克隆到pFastBacHTa载体上,构建重组杆粒rBacmid-HA,在脂质体介导下转染Sf9细胞制备重组杆状病毒,表达HA蛋白,并通过血凝抑制试验、Westernt-blot、间接免疫荧光试验研究其生物学活性。结果显示,在Sf9细胞中成功表达了HA蛋白,分子量约为65kD,且表达蛋白具有良好的生物学活性。

禽流感病毒H5、H9亚型的多重RT-PCR鉴别诊断

根据禽流感病毒H5、H9亚型的HA基因序列 ,设计了两对RT_PCR引物 ,同时对H5、H9亚型进行了多重RT_PCR扩增 ,得到了两条清晰的目的带。将目的带回收并进行测序 ,同源性比较结果证明其为禽流感H5、H9亚型的HA基因序列 ,作者对多重RT_PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定 ,证明该方法的敏感性和特异性都比较好。初步应用于 30份临床病料 ,其检测结果与病毒的分离培养一致 ,比电镜和琼扩的检出率高 ,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应 ,可用于禽流感病毒H5。

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

【目的】制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持。【方法】以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。【结果】经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为2~7~2^(10),腹水HI效价为2^(16)~2^(19);单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于Ig G1亚类,其轻链均为K链。3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好。【结论】用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性。

禽流感H9亚型一步法RT-PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感H9检测方法,本研究根据GenBank中收录的禽流感H9病毒高度保守的基因序列,设计1对H9的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的PCR,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感H9病毒一步法RT-PCR检测方法,在此基础上完成了试剂盒的组装,对30份疑似禽流感病料的检出率高达98%以上,检测灵敏度达101.5 ELD50,稳定性良好,冷冻保存期达12个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。

用于禽流感H9亚型检测的压电免疫蛋白芯片的研制

目的：研制禽流感H7亚型检测的压电免疫蛋白芯片。方法：采用聚乙烯亚胺（PEI）粘附、戊二醛（Glu）交联的方法，将禽流感H9抗原固定于石英晶体的金电极表面。研究了敏感材料的浓度、pH值对其固定的影响。结果：该芯片用于检测浓度范围为0．123～1．23mg／ml的禽流感H9血清时，呈线性相关，相关系数0．9854。结论：检测阳性样品的响应值与阴性样品的噪声值之比大于2，可用于定性定量检测。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10^3 TCID50免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10^3-10^6TCID50)rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以108EID50的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10^3 TCID50免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10^3TCID50剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10^4-10^6TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:22.4-1:23。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10^3、10^4、10^6TCID50免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10^5TCID50免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针。将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象。同时敏感性高,检测禽流感病毒H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 0001、000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型。所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%。用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%。

河南部分地区H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及交叉免疫攻毒保护试验

为了分离鉴定河南漯河、郑州H9亚型禽流感病毒及交叉免疫攻毒保护试验。于2011年用SPF鸡胚从河南漯河、郑州疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离出2株病毒,通过血凝及血凝抑制试验和RT-PCR方法进行鉴定,确定为AIVH9亚型;用河南省动物性食品安全重点实验室于2001年分离的2株H9亚型禽流感病毒分别制成油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,然后再用上述4株病毒对免疫鸡群进行交叉攻毒,进行交叉免疫保护试验,测定其交叉免疫保护作用。结果表明:成功分离出2株H9亚型禽流感病毒;用2001年分离毒株所制备出的灭活疫苗免疫鸡后,试验鸡体内抗H9亚型禽流感HI抗体效价均明显上升,平均HI效价均大于11log2,不同毒株所诱导产生的HI抗体效价存在一定的差异;不同时期及地点分离的H9亚型禽流感流行毒株间均产生了较好的交叉保护,且同一地区的保护率更高,2001年的分离株对目前的流行毒株仍有很好的保护作用。

两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力

将H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因插入到具有新复制非必需区的通用型质粒载体pP12LS中构建转移载体pP12LSH9A,再分别转染预先感染不同毒力的2种鸡痘病毒(FPV)282E4株和LP株的鸡胚成纤维细胞,经系列蓝斑筛选纯化,获得了2种重组鸡痘病毒(rFPV),分别命名为rFPV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A。将这2株rFPV在SPF鸡和带有高水平抗H9亚型AIV母源抗体的商品鸡上分别进行免疫效力试验。结果:rF-PV282-12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A在SPF鸡上的排毒保护率均为100%(10/10),在商品鸡上的排毒保护率分别为88%(23/26)和92%(24/26)。结果表明获得了2株在带有抗H9亚型AIV高水平母源抗体的商品鸡上免疫效力较好的rFPV。

豫西地区H9亚型禽流感病毒分离鉴定及HA基因的序列分析

为了了解禽流感的生物学特性和遗传进化规律,有效防治禽流感疫情,本试验从河南省洛阳地区发现疑似H9亚型禽流感的病死鸡中分离得到两株病毒(LYPLK1和LYPLK2),经鉴定为H9亚型禽流感病毒,通过RT-PCR方法扩增其HA基因进行序列分析。结果分离株属于H9亚型禽流感欧亚系Y280/97分支,并发生了一定的变异。

上海地区活禽批发市场H9亚型禽流感病毒调查

为弄清上海地区活禽批发市场中H9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的流行情况及鸡群的免疫情况,2009年对上海三大活禽批发市场进行了采样监测。采用HI试验检测H9 AIV抗体、荧光RT-PCR试验和鸡胚接种分离鉴定病毒。共采集110批次1 646份血样和喉头泄殖腔棉拭样品,平均抗体合格率为60.27%,分离到H9病毒134株,其中4-6月和9-11月为全年中病毒分离的2个高峰期（样品带毒率均超过了10.00%）,明显比其它月份要高（其他月份均低于5.00%）,样品带毒率平均为8.14%。不同市场、不同地区采集的样品其抗体合格率和样品的带毒率也存在一定的差异。在30批分离到病毒的样品中,13批次已免疫H9N2油乳剂灭活苗且抗体合格率均大于70.00%的样品中分离到45株病毒（45/195）,其中6批次抗体合格率达到100%的样品中也分离到了病毒（8/90）,但带毒率明显比未经疫苗免疫的样品（79/255）低。调查结果表明养殖户对肉鸡群H9N2油乳剂灭活苗免疫重视程度不够,鸡群中带毒现象较普遍。疫苗免疫后能产生较高的免疫抗体,且抗体能减轻临床症状,降低带毒率,但不能完全阻止病毒复制,存在高抗体下带毒现象。

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1(+)质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9。将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,产物处理后进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹和薄层扫描分析。结果发现HA蛋白可被大量表达,主要以包涵体形式存在,表达产物分子质量约64 ku,与理论推测值一致;菌液OD600值为1.0、IPTG终浓度为0.3 mmol.L-1、诱导时间4 h,其蛋白表达量最大,约占菌体蛋白总量的35%左右;通过免疫印迹试验发现,表达的蛋白可被禽流感H9亚型阳性血清特异性识别。研究结果表明,可以用原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,其产物具有免疫原性,可以用作禽流感抗体检测的免疫诊断试剂。

2015～2016年大连地区肉鸡H9亚型禽流感流行病学调查研究

为调查大连地区肉鸡中H9亚型禽流感(Avian influenza,AI)的流行与分布情况,从2015年2月到2016年8月期间,采集肉鸡屠宰厂、肉种鸡场和商品肉鸡场的肉鸡血清、喉头/泄殖腔拭子及组织等样本,进行H9 AI HI抗体检测、荧光RT-PCR病原检测、鸡胚接种分离病毒和RT-PCR亚型鉴定,结果表明未免疫商品肉鸡H9 AI血清抗体阳性率为12.1%,喉头/泄殖腔拭子病原阳性率为3.7%,免疫麻羽商品肉鸡也检测到H9禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),而因呼吸道病死淘的商品肉鸡H9AIV感染率高达41%,并分离到4株H9N2亚型AIV。肉种鸡场H9亚型禽流感血清抗体效价高,整齐度好,未检测到H9AIV。数据表明,H9AIV在商品肉鸡中存在较广,不但影响肉鸡的生产性能,还存在公共卫生安全隐患,有必要重视和加强肉鸡H9亚型AI的防控。

广西H9亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究

通过对2011年—2014年从广西不同地区的活禽市场、养鸡场、野生鸟类保护区等地采集的咽喉腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到17株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示所有分离株经鉴定均为H9N2亚型禽流感病毒。对所有分离株的生物学特性进行研究,发现17株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点,其中16株分离株通过受体亲和特性测定证明具有SAα2,3及SAα2,6两种受体结合特性,提示具有感染哺乳动物的潜能。

2011-2014年山东省H9亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

对2011-2014年山东26个H9亚型AIV毒株的HA基因进行测序分析。结果显示,所有毒株均属于h9.4.2.5亚分支,与疫苗株GD/SS/94、SD/6/96、SH/F/98的核苷酸相似性为88.0%-91.5%。HA裂解位点均只有一个碱性氨基酸（R）,符合低致病性AIV的特征。所有毒株在234位发生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突变,呈现出典型的人流感病毒受体结合特性。所有毒株在313-315位均新增1个潜在糖基化位点,且部分毒株在145-147位出现新潜在糖基化位点NGT。结果表明,山东省H9亚型AIV基因已发生较大变异,因此需要加强禽类生产贸易的监测和生物安全措施,及时更新疫苗毒株,控制H9亚型AIV的传播。

2014年云南家禽H9亚型禽流感病毒的检测分析

为了掌握云南省2014年家禽H9亚型禽流感感染和病原变异情况,试验采用RT-PCR方法对云南省98个发病鸡场组织病料进行H9亚型禽流感检测,并对2株代表性毒株进行HA基因测序。结果表明：28个鸡场出现H9亚型禽流感核酸阳性,阳性率为28.6%;分离获得的2株云南省H9亚型禽流感病毒HA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.5%和98.7%,均属于欧亚分支ACKBJ194分支（分支Ⅲ）;与广东ACKGDCYH122011、广西ACKGXQCR102011毒株之间的核苷酸同源性为97.9%~98.1%,与ADKHY43997（分支Ⅰ）和AQUAILHKG197（分支Ⅱ）的核苷酸同源性为82.5%~86.6%;与广东ACKGDCYH122011、广西ACKGXQCR102011毒株之间的氨基酸同源性为97.5%~98.0%,与ADKHY43997（分支Ⅰ）和AQUAILHKG197（分支Ⅱ）的氨基酸同源性为87.0%~89.7%;HA基因编码蛋白裂解位点序列均具有低致病性病毒分子特征。说明云南省2014年家禽H9亚型禽流感病毒仍为弱毒株。

商品鸭H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

[目的]对某肉鸭场病死鸭进行病原学诊断。[方法]通过细菌分离培养等常规细菌学鉴定方法,并结合PCR、RT-PCR等分子生物学手段对病死鸭的病原体进行分离与鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。[结果]该批病死鸭的发病原因确定为H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染。药敏试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌只对多西环素、头孢他啶以及环丙沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物敏感。[结论]该药敏试验结果可为临床预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的用药选择提供一定的参考依据。