天冬氨酸激酶(AK)编码基因的克隆及其序列分析

用PCR方法从谷氨酸棒杆菌突变株ZL9601基因组中扩增获得了天冬氨酸激酶(AK)编码基因,并对该基因编码区(1263bp)进行了序列分析。结果表明:本文扩增的AK基因编码与文献报道的序列基本一致,通过与不同作者克隆的AK基因序列进行比较,同源性最高达99 7%,最低达97 2%。这些碱基的差异均表现为碱基取代,多数碱基取代未引起编码氨基酸的改变,仅有少数碱基取代导致编码氨基酸的变化。由此可见,谷氨酸棒杆菌AK基因的碱基序列存在着多态性。

大豆AK基因的克隆与序列多样性分析

基于NCBI网站下载获得的大豆AK基因cDNA序列设计特异引物,以大豆品种东农42总RNA为模板,通过RT-PCR获得约1 690 bp cDNA片段,经序列比对认定为AK基因序列。以19个赖氨酸和蛋氨酸含量特殊的大豆品种为材料,采用相同方法在RNA中进行扩增,并对产物测序,利用软件对所得序列进行分析。结果显示：在不同的大豆品种中AK基因的核酸序列存在两种变异方式,第一种是在336 bp产生1个T碱基突变的基因序列,第二种是在1 369-1 374 bp处出现“CAAGTG”6个碱基插入的序列;在蛋白质水平上,主要是在456-457个氨基酸处存在A和S两个氨基酸插入突变。AK基因结构完整,其编码的蛋白产物具有AA_kinase、Carbamate kinase-like、Aspartate kinase和ACT保守结构域。本研究首次对大豆中AK基因多样性进行了分析,为大豆天冬氨酸代谢途径其它相关酶基因的研究提供了理论依据,也为大豆AK基因在植物基因工程等领域的研究和应用奠定了良好的基础。

四种鳞翅目害虫精氨酸激酶基因的表达谱及基于RNAi的功能分析

【目的】精氨酸激酶(arginine kinase,AK)(EC2.7.3.3)是昆虫体内重要的磷酸原激酶(能量代谢调节因子),也是唯一能够形成有效ATP的磷酰基供体,起着与脊椎动物中肌酸激酶相同的作用。本研究旨在了解鳞翅目害虫AK基因的表达和功能。【方法】利用qRT-PCR方法测定AK基因在大螟Sesamia inferens、二化螟Chilo suppressalis、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura这4种鳞翅目害虫不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中的表达谱;通过终点法检测了这4种害虫不同发育阶段和幼虫不同组织中的AK酶活性;采用RNAi技术抑制该基因的表达并分析其功能。【结果】AK基因在大螟、二化螟、甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这4种鳞翅目昆虫的不同发育阶段和3龄幼虫不同组织中均有表达,说明该基因的表达不具有发育时期和组织特异性。不同发育时期和3龄幼虫不同组织中AK酶活性与基因表达量变化趋势大体一致。注射以AK基因为靶标的dsRNA6d后,4种害虫体内AK基因的mRNA表达下降30%~50%,AK酶活性降低30%左右;14d后幼虫的死亡率达50%左右,显著高于对照组幼虫的死亡率。【结论】AK基因在上述4种鳞翅目害虫中为组成型表达,RNAi抑制AK基因的表达可导致4种害虫的幼虫死亡,研究结果为开发以AK基因为靶标的鳞翅目害虫防治新技术提供了理论依据。

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kinase,AK)基因真核表达载体并予以鉴定。方法根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性。克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1(+),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性。结果经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段。结论成功地构建了基因真核表达载体。

两种水稻蛀茎害虫精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

精氨酸激酶(AK, EC 2.7.3.3)是昆虫体内唯一的磷酸原激酶,参与能量代谢。为探究AK基因的作用,本文利用本实验室建立的cDNA文库及RACE技术,分别从两种重要的水稻蛀茎害虫稻蛀茎夜蛾Sesamia inferens和二化螟Chilo suppressalis中克隆获得了AK基因的cDNA全长序列,并对其序列特征进行分析。AK基因分别命名为SinAK(稻蛀茎夜蛾,GenBank登录号:MK559476)和CsuAK(二化螟,MK559475),开放阅读框(ORF)长为1 065 bp,编码355个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.0 kDa,等电点为5.88。氨基酸序列分析结果显示SinAK、CsuAK基因编码的氨基酸序列具有AK典型的功能位点保守序列:底物识别域S62G63V64-Y67和酶活性中心序列CP(S/T)N(I/L)GT。氨基酸序列比对及系统进化关系分析表明,SinAK与甜菜夜蛾、草地贪夜蛾和斜纹夜蛾的同源性最高,达95%以上,而CsuAK与印度谷螟、亚洲玉米螟的进化关系较近,同源性在95%左右。SinAK、CsuAK与其他昆虫AK的氨基酸序列同源性也高于80%,而与部分脊椎动物起同样作用的肌酸激酶(CK)的同源性低于40%,说明AK基因的功能是高度保守的,且与脊椎动物CK同源性很低。本研究结果为进一步研究SinAK和CsuAK的功能以及开发以AK基因为靶标的、对高等动物安全的害虫防治新技术奠定基础。

血斑酸性磷酸酶、腺苷激酶、腺苷脱氨酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶同时电泳分型

本文作者介绍了利用薄层淀粉凝胶电泳对血斑酸性磷酸酶(EAP)、腺苷激酶(AK)、腺苷脱氨酶(ADA)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)同时电泳分型的方法,同时报道了这四种酶在北京地区汉族人中的表型分布和基因频率.