大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD 1和AKT 3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制,试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD 1和AKT 3基因启动子区的多态性进行检测,同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD 1和AKT 3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示,MYOD 1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域,且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内;AKT 3基因共预测到6个核心启动子区,未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD 1基因在G-361T处存在1个SNP突变,但在本试验群体中只发现1种基因型,同时该突变位点位于第1个核心启动子区内;AKT 3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变,包括TT、TC和CC 3种基因型,其中TT基因型为优势基因型,T为优势等位基因。遗传多态性分析提示,该突变位点多态信息含量(PIC)介于0.25~0.5之间,表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD 1和AKT 3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件,为进一步研究MYOD 1、AKT 3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。

14-3-3σ负调控Akt抑制Rat1-Akt细胞成瘤性

目的:研究腺病毒介导14-3-3.σ(Ad-14-3-.3σ)对Akt过表达Rat1-Akt细胞成瘤性的作用,并探讨其作用是否通过负调控Akt而实现。方法:通过半体内和体内实验观察Ad-14-3-.3σ转染对Rat1-Akt细胞在裸鼠中成瘤性的影响;采用W estern b lotting方法检测转染14-3-.3σ基因后肿瘤组织内14-3-.3σ蛋白及其对Akt蛋白、Akt磷酸化活性和Akt磷酸化底物水平的影响。结果:无论体外用Ad-14-3-3σ处理Rat1-Akt细胞,还是体内经瘤内注射Ad-14-3-3σ,均可见14-3-3.σ可使荷瘤鼠肿瘤体积显著缩小(P<0.05),出现肿瘤的时间推迟,其中以长时间不间断给药疗效最好;转染14-3-.3σ基因治疗组的肿瘤组织中Akt蛋白、Akt-Thr308位点磷酸化活性及Akt磷酸化底物水平低于转染Ad-β-gal或PBS处理的对照组。结论:14-3-3σ可抑制Rat1-Akt细胞在裸鼠中的成瘤性,14-3-3σ通过负性调控Akt蛋白水平和磷酸化活性而抑瘤。

外源性SHIP基因表达抑制生长因子介导的K562细胞增殖及Akt磷酸化

【目的】探讨SHIP基因对IL-3诱导K562细胞系增殖的抑制作用,阐明SHIP对K562细胞作用的机制。【方法】将慢病毒质粒pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞;转染细胞与IL-3共培养,Western blot法检测K562细胞Akt磷酸化;观察转染野生型SHIP基因对K562细胞增殖的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡。【结果】重组慢病毒载体pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞,GFP阳性率为74.6%。野生型SHIP基因阻断了IL-3对K562细胞的增殖作用,对照组(K562/FIV)细胞增殖抑制率(3.26%)明显低于转染SHIP基因组细胞增殖抑制率(26.42%,P<0.05);集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[IL-3作用组K562/SHIP细胞形成集落为60.3±6.6,明显低于IL-3诱导的K562/FIV组(91.7±4.2)](P<0.01)。细胞形态观察发现凋亡增加,Western blot检测发现转染SHIP基因组前凋亡酶pro-caspase-3降解增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。IL-3作用不同时间段(3h,6h,12h),转染野生型SHIP组细胞增殖明显减弱,且Akt磷酸化水平均低于对照组(P<0.05)。【结论】SHIP基因负调控生长因子(IL-3)介导的K562细胞增殖及其蛋白激酶活化。

PTEN功能调节的研究进展

PTEN是具有蛋白与脂质磷酸酯酶活性的双特异性磷酸酯酶,能特异地使磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸3′位脱磷酸,抑制PI3K/Akt信号转导途径,从而在细胞的生长、分化、凋亡、迁移等方面起着重要的调控作用。PTEN的异常与多种人类肿瘤如子宫内膜瘤、前列腺癌、乳腺癌等的发生、侵袭及转移密切相关。在细胞中,PTEN功能受到蛋白表达、磷酸化、氧化以及膜定位等因素的调节。该文就PTEN调节的分子机制作一综述。

野生型PTEN基因增强青蒿琥酯抑制K562细胞的作用

目的:探讨野生型PTEN转染人白血病K562细胞系对青蒿琥酯敏感性的影响及其分子作用机制。方法:将野生型PTEN以腺病毒为载体转染(感染复数为200)人白血病K562细胞(Ad-WT-PTEN),同时以转染空载体腺病毒(Ad)及未转染细胞为对照组,与青蒿琥酯(ART)联合作用,观察野生型PTEN增强青蒿琥酯抑制K562细胞的作用。根据IC50计算PTEN对青蒿琥酯的增敏倍数。以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,real-time PCR检测PTEN的mRNA水平,Western blot检测PTEN、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平;caspase活性检测试剂盒检测caspase-3/7的活性。结果:Ad-WT-PTEN转染K562细胞后,对青蒿琥酯敏感性明显增加,依据IC50计算增敏倍数为2.25倍。至第3天,Ad-WT-PTEN+ART组较Ad+ART组细胞活力下降、凋亡率升高。Ad-WT-PTEN转染K562细胞后PTEN的mRNA及蛋白表达明显增加,p-Akt水平及caspase-3/7活性下调,以PTEN及青蒿琥酯联合作用组下调尤为明显。结论:野生型PTEN可能通过降低K562细胞Akt磷酸化的水平,并增加caspase-3/7活性,增强细胞对青蒿琥酯的敏感性。

胃腺癌组织再生基因蛋白Ⅳ的表达及临床意义

目的探讨再生基因蛋白Ⅳ(regenerating gene typeⅣ,RegⅣ)在胃腺癌发生发展中的可能价值及意义。方法采用S-P免疫组织化学技术测定63例胃腺癌及相应的癌旁正常组织中RegⅣ及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Akt蛋白的表达;分析胃癌患者不同临床病理特征下RegⅣ、PI3K、Akt蛋白的表达差异,并分析胃癌组织RegⅣ蛋白与PI3K、Akt蛋白表达的相关性。结果 63例胃腺癌组织中RegⅣ、PI3K、Akt蛋白的阳性表达率为50.7%(32/63)、68.3%(43/63)、60.3%(38/63),均高于癌旁正常组织19.0%(12/63)、20.6%(13/63)、9.5%(6/63),差异有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤分化程度间RegⅣ蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);不同肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移与否、临床分期间PI3K蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);淋巴结转移与否胃癌组织Akt蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。胃腺癌组织中RegⅣ蛋白与PI3K、Akt表达正相关(rs=0.284、0.305,P<0.05),PI3K蛋白与Akt蛋白表达正相关(rs=0.423,P<0.05)。结论 RegⅣ高表达与胃腺癌发展相关,PI3K/Akt信号通路的激活可能参与其中。

牙源性角化囊肿增殖调控基因的筛选

目的利用转录组测序技术(RNA-seq)筛选与牙源性角化囊肿(OKC)增殖相关的关键基因。方法收集OKC囊壁组织及正常口腔黏膜组织标本并提取总RNA,利用RNA-seq分析全基因转录本的差异,并分析差异表达基因(DEGs)的功能。结果OKC囊壁组织与正常口腔黏膜组织间共有359个DEGs,其中169个基因表达上调,190个基因表达下调。KEGG通路富集分析表明,注释在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路的DEGs共15个,包括8个上调基因和7个下调基因。结论OKC中存在PI3K-Akt信号通路基因的异常表达,PI3K-Akt信号通路相关基因在OKC增殖中可能发挥一定的调控作用。

PTEN/PI3K突变对肺癌细胞基因表达谱的影响

目的:探讨第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)基因突变对肺癌细胞基因表达谱的影响。方法:采用蛋白质印迹法检测19株非小细胞肺癌细胞中PTEN表达情况,测序验证PTEN基因是否发生突变,检测该突变对于PTEN下游分子AKT和mTOR通路产生的影响。利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)方法对19株肺癌细胞的基因表达谱数据进行PTEN/PI3K突变的功能分析。结果:19株非小细胞肺癌细胞中有5株PTEN蛋白表达缺失,通过测序发现这5株均存在PTEN突变;文献检索另有2株存在PIK3CA突变。PTEN突变后其下游分子AKT和mTOR通路处于持续活化状态。借助GSEA法对肺癌细胞基因表达谱数据进行分析,发现PTEN(或PI3K)突变对肺癌细胞的线粒体-能量代谢的基因集产生了重要影响。结论:PTEN/PI3K突变对其下游分子AKT和mTOR通路产生明显影响,对肺癌细胞基因表达谱的影响主要体现在线粒体-能量代谢方面的基因集。这一发现提示,有必要重视线粒体-能量代谢在肺癌发生中的作用。

脊髓小脑共济失调症相关蛋白Ataxin-3抑制张力蛋白同源基因通过蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路促进睾丸癌细胞增殖的机制

目的探究脊髓小脑共济失调症相关蛋白(Ataxin)-3在睾丸癌(TC)组织中的表达及促进TC细胞增殖的机制。方法选取2015年1月至2019年5月在濮阳市人民医院泌尿外科接受睾丸切除术患者的TC组织及癌旁组织标本共38对,以免疫组化染色、实时荧光定量PCR检测Ataxin-3表达,以CCK8实验检测TC细胞增殖情况,并以免疫印迹检测Ataxin-3过表达或敲除后张力蛋白同源基因(PTEN)及蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)信号通路相关蛋白水平。结果Ataxin-3蛋白和mRNA在TC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05),Ataxin-3表达与TC患者的年龄、病理类型无关(P>0.05),而与临床分期及转移明显相关(P<0.05)。当Ataxin-3蛋白在TCam-2细胞中过表达时可促进细胞增殖,而在TCam-2细胞中转染siRNA,敲除Ataxin-3后可抑制细胞增殖和侵袭。Ataxin-3过表达时TCam-2细胞中PTEN蛋白表达明显抑制,而敲除后PTEN表达上调。进一步检测AKT/mTOR信号相关蛋白的表达及磷酸化,显示Ataxin-3过表达时AKT、mTOR无明显变化,但AKT、mTOR磷酸化明显上调,真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)磷酸化明显下降;而Ataxin-3敲除后,p-AKT、p-mTOR表达明显抑制,4E-BP1磷酸化明显上调。结论Ataxin-3在TC组织中呈高表达,且与TC进展有关,其可能机制为Ataxin-3抑制抗癌基因PTEN通过激活AKT/mTOR信号通路而促进TC细胞增殖。