灯盏细辛总咖啡酰奎宁酸调控PI3K/Akt/FoxO3a通路延缓衰老的作用机制研究

研究灯盏细辛总咖啡酰奎宁酸(caffeoylquinic acid from Erigeron breviscapus,EBCQA)的抗衰老作用,并探讨其潜在作用机制。以线虫为模型,观察EBCQA对其寿命、氧化抗性、热抗性、运动能力、DAF-16入核、以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响。腹腔注射D-半乳糖构建衰老大鼠模型,检测EBCQA对大鼠学习记忆能力、胸腺和脾脏系数、肝脏中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Akt/protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(phosphp-Akt,p-Akt)、叉头框蛋白O3a(forkhead box class O3a,FOXO3a)、磷酸化FOXO3a(phosphp-FOXO3a,p-FOXO3a)表达,以及肝脏和血清中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影响。结果显示,EBCQA能够延长野生型线虫寿命,并提升其氧化抗性、热抗性和运动能力,但对线虫PI3K、Akt、FoxO3a同源体突变株寿命没有显著影响;EBCQA能促进DAF-16入核,通过DAF-16提升线虫的SOD、GSH-Px、CAT活性,降低MDA水平。在D-半乳糖诱导衰老大鼠中,EBCQA给药显著改善大鼠的学习记忆功能,提升胸腺和脾脏系数,降低PI3K、Akt、p-Akt、p-FoxO3a表达和MDA含量,增强SOD、GSH-Px、CAT活性。以上结果表明,EBCQA具有延缓衰老的作用,其机制可能与抑制PI3K和Akt激活、降低FOXO3a磷酸化、促进FOXO3a入核和转录活性、提升抗氧化酶活性和抑制氧化应激相关。

红黄煎剂通过调节AKT/FoxO3a通路改善阿霉素造成的心肌细胞凋亡

目的：阿霉素是一种临床常用的化疗药物,其心脏毒性制约了它的临床使用,为了了解红黄煎剂在体外对阿霉素造成的心脏损伤降的作用,并探讨机制,做如下体外实验。方法：体外培养H9c2心肌细胞。用不同浓度红黄煎剂（HHD）,阿霉素（DOX）,红黄煎剂＋阿霉素分别处理H9c2心肌细胞24 h,MTT法检测细胞活力,TUNEL和DAPI双染法检测细胞凋亡率,Western Blot法检测细胞凋亡相关蛋白。然后Si-Fox O3a转染H9c2心肌细胞,免疫荧光及Western Blot法确定转染效果,western及MTT法检测红黄煎剂,阿霉素,红黄煎剂＋阿霉素对Si-Fox O3a转染的H9c2心肌细胞的作用。结果：不同浓度（0-2 mg·m L-1）的红黄煎剂作用与H9c2细胞,发现对细胞有一定的促进增值的作用（P 〈0. 05）,阿霉素作用与H9c2细胞,其IC 50为（3. 03±0. 11）μM,加用红黄煎剂以后发现其抑制曲线下移,其IC 50为（7. 07±0. 48）μM,其差异有统计学意义（P 〈0. 01）。TUNEL＆DAPI双染法检测细胞凋亡,发现HHD＋DOX将单用DOX组的凋亡率从（43. 23±5. 22）%下调到（25. 22±3. 21）%。其差异有统计学意义（P 〈0. 01）。红黄煎剂能显著下调阿霉素引起的Caspase-3的激活（P 〈0. 05）,同时能上调生存蛋白Bcl-2（P 〈0. 05）。同时红黄煎剂能够提高H9c2细胞中的Akt/Fox O3a磷酸化的水平。转染siFox O3a后细胞增值率下降（P 〈0. 05）,并且减弱了HHD促进细胞增值的作用（P 〈0. 05） Western Blot检测也证明了HHD在转染细胞系中的保护作用降低（P 〈0. 05）。结论：红黄煎剂能降低阿霉素诱导的心肌细胞凋亡,其可能是通过调节AKT/Fox O3a产生的。

木糖醇通过调节PI3K/Akt/FoxO1/NF-κB通路改善2型糖尿病小鼠肾损伤

目的探究木糖醇改善2型糖尿病(T2DM)肾损伤的作用机制。方法将小鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病对照组(DC组)、10%木糖醇组(DX10组)、20%木糖醇组(DX20组),每组6只。除NC组外,其余各组小鼠均用链脲佐菌素(40 mg/kg)构建T2DM模型。造模成功后,在正常饲料中加入不同比例的木糖醇连续喂养8周。通过试剂盒检测小鼠空腹血糖(FBG);采用ELISA法测定血清中白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;比色法检测肾组织过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC);苏木精-伊红(H-E)染色观察肾组织的形态学变化;Western-blot法检测小鼠肾组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-FoxO1、FoxO1、NF-κB、ICAM-1、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。结果(1)与NC组比较,DC组FBG升高(P<0.01),木糖醇干预后下降,且DX20组下降更显著(P<0.05);(2)与NC组比较,DC组IL-6和TNF-α分泌增加(P<0.0001),木糖醇干预后均下降,且DX20组下降更显著(P<0.0001);(3)与NC组比较,DC组CAT和T-AOC活性下降、MDA含量升高(P<0.01),木糖醇干预后,CAT和T-AOC活性升高而MDA含量降低(P<0.05),且DX20组变化更显著(P<0.05);(4)H-E染色显示,木糖醇干预可改善小鼠糖尿病肾损伤,且DX20组效果更佳(P<0.05);(5)Western-blot检测显示,与NC组比较,DC组小鼠肾组织中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1和Bcl-2/Bax均降低(P<0.0001,P<0.001,P<0.01,P<0.001)、NF-κB入核增多(P<0.0001)、ICAM-1升高(P<0.01);与DC组比较,木糖醇干预可逆转相关蛋白的变化,且DX20组变化更显著(P<0.05)。结论木糖醇可通过活化PI3K/Akt/FoxO1及抑制NF-κB通路改善T2DM小鼠肾损伤。

丹参酮IIA通过激活AKT/FOXO3a通路减轻七氟醚诱导的大鼠神经元细胞毒性

目的 探究丹参酮IIA(Tan IIA)减轻七氟醚(Sev)诱导的大鼠神经元细胞毒性的机制及其对AKT/FOXO3a通路产生的影响。方法 将大鼠神经元细胞HT22分为对照组、Sev组、TanIIA干预组与Sev+Tan IIA+LY294002组。CCK-8实验筛选最佳TanIIA浓度;CCK-8检测各组细胞活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;试剂盒检测各组细胞MDA、SOD及GSH水平;Western blot检测各组细胞HO-1、 NQO1、AKT、p-AKT、FOXO3a及p-FOXO3a的蛋白表达。结果 Tan IIA的最佳处理浓度为3μg/mL。Sev能够导致细胞毒性,诱导细胞凋亡,导致氧化应激;Tan IIA对Sev诱导的细胞毒性、凋亡以及氧化应激具有保护作用,而抑制AKT则抵消了Tan IIA对Sev诱导的细胞毒性保护作用,抵消了Tan IIA对Sev诱导的细胞凋亡和氧化应激的抑制作用。此外,Tan IIA激活了AKT/FOXO3a通路。结论 丹参酮IIA通过激活AKT/FOXO3a通路减轻七氟醚诱导的大鼠神经元细胞毒性。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

“秩边透水道”针刺对卵巢低反应小鼠PI3K/AKT/FOXO3a通路的影响

目的:基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/叉头蛋白O3a(FOXO3a)通路观察“秩边透水道”针刺对卵巢低反应(POR)小鼠卵巢功能的保护作用,探析针刺抑制POR卵巢颗粒细胞凋亡的可能机制。方法:将动情周期规律的45只小鼠随机分成空白组、模型组和针刺组,每组15只。模型组和针刺组小鼠予雷公藤多苷混悬液(50 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃2周制备POR模型。造模成功后针刺组小鼠予“秩边透水道”针刺干预连续2周,每日1次,每次20 min。干预结束次日开始促排卵,各组促排卵后完成取材。采用阴道脱落细胞涂片观察小鼠动情周期变化,记录小鼠取卵数、卵巢湿重、末次体质量与卵巢指数;ELISA法检测小鼠血清抗缪勒管激素(AMH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、黄体生成素(LH)含量;HE染色法观察小鼠卵巢组织形态;TUNEL染色法观察小鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR法检测小鼠卵巢组织PI3K、AKT、FOXO3a mRNA表达;Western blot法检测卵巢组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)关联X的蛋白(BAX),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠动情周期紊乱率升高(P<0.01);与模型组比较,针刺组小鼠动情周期紊乱率降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠取卵数、卵巢湿重、卵巢指数和末次体质量降低(P<0.01);与模型组比较,针刺组小鼠取卵数、卵巢指数和卵巢湿重升高(P<0.01,P<0.05),末次体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,模型组小鼠血清FSH、LH含量升高(P<0.01),血清AMH、E2含量降低(P<0.01);与模型组比较,针刺组小鼠血清FSH、LH含量降低(P<0.01,P<0.05),血清AMH、E2含量升高(P<0.01,P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠卵巢组织各级正常发育卵泡数量减少且形态较差,各级闭锁卵泡增多;与模型组比较,针刺组小鼠卵泡数量、形态和颗粒细胞结构有不同程度改善,各级闭锁卵泡减少。与空白组比较,模型组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡率升高(P<0.01);与模型组比较,针刺组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡率降低(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠卵巢组织FOXO3a mRNA及Caspase-3、BAX蛋白表达升高(P<0.01),卵巢组织PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT和p-FOXO3a蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较,针刺组小鼠卵巢组织FOXO3am RNA及Caspase-3、BAX蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),卵巢组织PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT、p-FOXO3a蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05)。结论:“秩边透水道”针刺可以抑制POR小鼠卵巢颗粒细胞凋亡,改善卵巢功能,其机制可能与调节PI3K/AKT/FOXO3a通路中的关键因子有关。

红花提取物通过调节PI3K/Akt/FoxO信号通路改善酒精性肝病

目的探讨红花提取物(Carthamus tinctorius L.extract,CTLE)对酒精诱导的肝损伤小鼠氧化应激、脂质代谢和凋亡水平的影响及其作用机制。方法采用慢性酒精喂养加急性酒精灌胃的酒精性肝病小鼠模型造模。小鼠被随机分为4组,造模期间每天观察小鼠状态变化并记录体质量。造模结束后,收集各组小鼠血液和肝脏组织。对小鼠血液进行生化分析。HE染色和油红O染色进一步评价小鼠肝脏病理损伤程度。应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blot法检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-FoxO1、FoxO1、p-FoxO3a、FoxO3a、p-FoxO4、FoxO4、BCL-2和BAX因子的mRNA和蛋白表达水平。结果与模型组相比,CTLE给药组小鼠肝脏病理损伤程度和脂质沉积有所改善;小鼠血清及肝脏中的生化相关指标,如ALT、AST、TG、TC、MDA水平有所降低,GSH、SOD水平有所升高。并且通过调控PI3K/Akt/FoxO通路产生了更多的SOD,减少了活性氧(reactive oxygen species,ROS)对机体的损伤和细胞凋亡。结论CTLE可以通过PI3K/Akt/FoxO通路发挥抗氧化应激和抗凋亡作用,减轻小鼠的酒精性肝损伤,为治疗酒精性肝病和开发相关药物提供新的思路。

褪黑素通过抑制PTEN/AKT/FOXO3a 通路遏制慢性应激下小鼠卵泡发育不良的机制

目的探究褪黑素通过抑制PTEN/AKT/FOXO3a通路在小鼠卵巢中的激活遏制慢性应激下小鼠卵泡发育不良的机制。方法选取60只6周龄雌性C57BL/6N小鼠,随机分为正常对照组、慢性应激组和褪黑素组,每组各20只。使用实验室称重仪记录小鼠的身体和卵巢的质量。通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测小鼠血清激素水平。通过组织学分析计算小鼠卵巢不同阶段的卵泡数量。通过ELISA和实时定量聚合酶链式反应(real-timefluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测小鼠血清抗米勒管激素(anti-Müllerianhormone,AMH)的表达。通过蛋白印迹法检测磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/叉头框转录因子3a(forkhead box transcription factor 3a,FOXO3a)信号通路的表达。通过PCR检测小鼠卵巢PI3K/AKT/FOXO3a的转录水平。统计学方法采用LSD-t检验、χ^(2)检验、单因素方差分析或重复测量资料方差分析。结果慢性应激组与正常对照组的初级卵泡数量[(174±30)个与(107±17)个,t=-148.098]、磷酸化张力蛋白同源物(p-phosphatase tensinhomolog deleted on chromosome ten,p-PTEN)蛋白(2.03±0.19与1.26±0.16,t=-32.207)、p-AKT蛋白(1.99±0.18与1.07±0.05,t=-70.021)、p-FOXO3a蛋白(2.18±0.20与1.18±0.11,t=-64.621)、皮质醇稳定蛋白(cortistatin,CORT)(137±12与83±7,t=-124.235)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)[(13.1±1.9)IU/L与(8.2±1.6)IU/L,t=-25.388]比较,慢性应激组水平高于正常对照组(P值均<0.05)。慢性应激组与正常对照组的小鼠身体质量[(22.5±2.5)g与(28.4±4.7)g,t=12.906]、卵巢质量[(9±3)mg与(23±5)mg,t=45.302]、雌二醇水平[(36±8)μg/L与(75±10)μg/L,t=88.937]、雄激素水平[(0.13±0.01)μg/L与(0.20±0.02)μg/L,t=23.123]、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平[(3.2±0.3)IU/L与(4.6±0.5)IU/L,t=31.170]以及原始卵泡数量[(87±9)个与(143±27)个,t=111.829]、次级卵泡数量[(92±11)个与(150±21)个,t=130.837]和窦卵泡数量[(43±5)个与(96±8个),t=144.851]比较,慢性应激组低于正常对照组(P值均<0.001)。褪黑素组与慢性应激组的p-PTEN/PTEN(1.15±0.14与2.03±0.19,t=4.983)、p-AKT/AKT(1.21±0.13与1.99±0.18,t=-12.108)、p-FOXO3a/FOXO3a(1.35±0.17与2.18±0.20,t=-11.274)、CORT[(106±10)μg/L与(137±12)μg/L,t=-50.392]和FSH水平[(10.2±1.5)IU/L与(13.1±1.9)IU/L,t=-10.317]比较,褪黑素组低于慢性应激组(P值均<0.001)。褪黑素组与慢性应激组的小鼠身体质量[(26.5±4.1)g与(22.5±2.5)g,t=5.182]、卵巢质量[(17±5)mg与(9±3)mg,t=19.588]、雌二醇水平[(66±6)μg/L与(36±8)μg/L,t=20.485]、雄激素水平[(0.21±0.02)μg/L与(0.13±0.01)μg/L,t=6.458]、LH水平[(4.3±0.4)IU/L与(3.2±0.3)IU/L,t=6.924]以及原始卵泡数量[(125±15)个与(87±9)个,t=38.784]、次级卵泡数量[(137±16)个与(92±11)个,t=29.063]和窦卵泡数量[(76±6)个与(43±5)个,t=49.447]比较,褪黑素组高于慢性应激组(P值均<0.001)。结论褪黑素通过抑制PTEN/AKT/FOXO3a通路成员的磷酸化,升高小鼠血清AMH水平,最终减轻慢性应激诱导的小鼠卵巢原始卵泡丢失和卵泡发育不良。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

葛根芩连汤通过IRS-1/PI3K/AKT通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响

目的探究葛根芩连汤通过胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响。方法将40只SD大鼠随机分为正常组(2 mL生理盐水灌胃)、造模组(2 mL生理盐水灌胃)、二甲双胍组(4.17 mg/100 g二甲双胍灌胃)和葛根芩连汤组(1 g/100 g葛根芩连汤灌胃),每组10只。采用高脂高糖饲料加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型,随后喂食油脂、42°白酒及蜂蜜水构建胃肠湿热型2型糖尿病大鼠模型。测量各组大鼠不同时间节点体质量,血糖仪测定空腹血糖(FBG);ELISA检测空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平变化、计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色检测肝组织病理学变化;检测肝组织过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量变化。Western blot检测肝组织IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白变化。结果与正常组比较,造模组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显下降(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著升高(P<0.05),可见局灶性肝实质损失。与造模组比较,二甲双胍组及葛根芩连汤组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显升高(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著降低(P<0.05),显示正常的肝实质。结论葛根芩连汤可明显改善胃肠湿热型2型糖尿病糖脂紊乱,可能是通过IRS-1/PI3K/AKT通路发挥作用。

达沙替尼基于PI3K/AKT信号通路调节乳腺癌细胞生物学行为

目的:基于PI3K/AKT信号通路探讨达沙替尼(dasatinib,DAS)对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。方法:分别使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、Transwell法、流式细胞术和Western blotting法检测DAS不同浓度(0、2、6、10μmol/L)作用下MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。同时设置对照组(溶媒对照)、DAS组(DAS 10μmol/L)、PI3K抑制剂组(LY29400220μmol/L)、联合组(DAS 10μmol/L+LY29400220μmol/L),比较各组细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:随着DAS作用浓度的升高,MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),侵袭细胞数、迁移细胞数和PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。与对照组相比,DAS组、PI3K抑制剂组、联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低。与PI3K抑制剂组、DAS组相比,联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高,PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。结论:DAS能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力,诱导细胞凋亡,其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

调补心肾方通过活化PI3K/Akt/mTOR通路促进阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性相关蛋白的合成

目的探讨调补心肾方(党参、制首乌、枸杞子、黄芪等)对阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性的影响及机制。方法取5月龄雄性野生型(WT)小鼠和5xFAD转基因小鼠各18只,分别随机分为对照组(0.9%NaCl)、调补心肾方组(颗粒剂,4.18 g·kg^(-1))、安理申组(盐酸多奈哌齐,0.625 mg·kg^(-1)),每组6只。按照上述分组灌胃给药,每日1次,共60 d。采用透射电镜观察小鼠海马组织超微结构;Western Blot法检测小鼠皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1、NMDAR1、p-CaMKⅡa、CaMKⅡa、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果与WT对照组比较,5xFAD对照组小鼠海马CA1区突触的超微结构不规则,线粒体萎缩、减少,线粒体嵴断裂、消失,突触膜弯曲不规则,突触囊泡减少,突触后致密物(PDS)变薄甚至断裂;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与5xFAD对照组相比较,5xFAD调补心肾方组小鼠海马CA1区突触的超微结构有明显变化,线粒体数量增加,突触囊泡增多,突触膜完整,突触后致密物有增厚现象;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论调补心肾方可能通过活化PI3K/Akt/mTOR通路,促进突触可塑性相关蛋白合成,进而改善AD的认知功能障碍。

基于转录组学分析PI3K/AKT通路对冷却滩羊肉贮藏期间肌肉代谢稳态的影响

为揭示磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信号通路在冷却滩羊肉贮藏期间代谢调控中的作用,采用高通量测序技术研究冷却滩羊肉经PI3K抑制剂LY294002注射处理后分别在贮藏期为0、4、8 d时转录组的变化。在对照组和LY294002处理组之间,0、4、8 d时被鉴定为显著差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)数分别为474、96、13。功能富集分析表明,DEGs主要与代谢稳态有关,如氨基酸的生物合成、糖酵解/糖异生、甘油脂类代谢过程。此外,组织切片分析显示,与对照组相比,LY294002组肌纤维间距增加,肌纤维直径显著减小,表明肌肉发生萎缩。结果表明,PI3K/AKT信号通路在维持滩羊肉贮藏过程中代谢平衡方面起着至关重要的作用,反过来又确保了肌肉的正常生长。研究为进一步阐明冷却滩羊肉贮藏中PI3K/AKT信号代谢稳态的分子机制提供了方向。

骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤的影响

目的探讨骨疏方调节FoxO3a/Wnt信号通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导成骨细胞损伤的影响。方法CCK-8法检测不同浓度(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的骨疏方对H_(2)O_(2)诱导的MC3T3-E1细胞活力。随后设置对照组、H_(2)O_(2)(150μmol/L H_(2)O_(2))组、骨疏方组、骨疏方+空载体组、骨疏方+FoxO3a过表达组。CCK-8法、ELISA分别检测细胞活力、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA);成骨诱导分化后,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒及茜素红分析ALP活性、细胞骨矿化结节;qRT-PCR检测成骨相关基因OPN mRNA、Runx2 mRNA以及FoxO3a mRNA表达水平;Western blot检测通路相关蛋白FoxO3a、Wnt2、β-连环蛋白(β-catenin)表达水平。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,骨疏方组MDA、FoxO3a表达显著降低,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著增加(P<0.05);与骨疏方+空载体组比较,骨疏方+FoxO3a过表达组MDA、FoxO3a表达显著增加,细胞活力、SOD、ALP活性、骨矿化结节数量、OPN mRNA、Runx2 mRNA、Wnt2、β-catenin表达显著降低(P<0.05)。结论骨疏方可改善H_(2)O_(2)诱导成骨细胞损伤,可能与抑制FoxO3a/Wnt信号通路有关。

茯苓酸调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的 研究茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢及细胞凋亡的调控作用。方法 通过细胞活性测定(Cell Counting Kit-8,CCK8)、克隆形成等实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞增殖与细胞活性的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞凋亡的影响;使用细胞氧气消耗率和细胞外酸化率测定仪器及细胞葡萄糖代谢水平测定试剂盒检测茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢的影响;通过蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)实验验证凋亡、糖酵解、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)通路相关蛋白表达情况。结果 茯苓酸能够有效抑制结直肠癌细胞增殖与细胞活性,并能够通过抑制其糖酵解水平促进其细胞凋亡,同时显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平。结论 茯苓酸可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进CRC细胞凋亡,可作为未来结直肠癌代谢靶向治疗的潜在药物。

重楼皂苷Ⅰ预防给药对心肌缺血再灌注损伤大鼠调节PI3K/AKT信号通路的作用研究

目的 从磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路探讨重楼皂苷I预防给药对心肌缺血再灌注损伤(MI/IR)大鼠的干预机制。方法 将购买的72只SPF级SD大鼠按照随机数字法分为假手术组、模型组、阿司匹林组、重楼皂苷I低、中和高剂量组,每组12只。分组后即给予相应药物干预2周,2周后构建MI/IR模型。模型构建成功24 h后先采用动物彩色多普勒超声仪检测心脏功能,后处死大鼠收集相关组织采用HE染色观察心肌病理学、TTC法检测心肌梗死面积,试剂盒检测心功能指标[乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和谷草转氨酶(AST),抗氧化指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)],TUNNEL染色检测心肌细胞凋亡特点,Western blot检测心肌PI3K、AKT、B细胞淋巴瘤/因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 假手术组心肌纤维排列整齐、无水肿,模型组有心肌纤维断裂,重楼皂苷I低、中、高剂量组和阿司匹林组明显改善心肌纤维断裂情况。与假手术组相比,模型组大鼠心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显升高(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH明显降低(P<0.05);相较于模型组,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组干预后,心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显降低(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH则明显升高(P<0.05)。Tunnel染色可见,假手术组几乎没有心肌细胞凋亡,而模型组呈现出明显的大量的细胞凋亡;与模型组相比,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组凋亡情况明显好转。此外,与假手术组相比,模型组大鼠心肌PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显降低,Bax明显升高(均P<0.05);相较于模型组,重楼皂苷I低、中、高剂量组以及阿司匹林组PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显升高,Bax蛋白表达明显降低(均P<0.05)。结论 重楼皂苷I对心肌缺血再灌注损伤有一定的预防作用,其作用机理可能与其能够调节PI3K/AKT信号通路有关。

(Pyr1)Apelin-13对布比卡因诱导停搏乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路的干预

目的:探讨Apelin/APJ系统在逆转布比卡因心肌毒性中的作用及机制。方法:提取乳鼠心肌细胞进行原代培养,随机分为4组:空白培养基组(DMSO组)、布比卡因1 mmol/L(Bup组)、(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(Apl组)和布比卡因1 mmol/L+(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(BAp组)。记录各组细胞基础自主搏动次数后,按照相应分组给药处理6 h。处理完毕后时间记为T0,记录T0至T12不同时间的细胞搏动次数;电镜下观察T12时心肌细胞线粒体形态;比色法检测T12时细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)含量;ELISA检测T12时心肌细胞中Apelin-13浓度;Western blot检测T12时心肌细胞中APJ、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达。结果:T0时Bup组全部心肌细胞停止搏动。与DMSO组比较,Bup组细胞搏动次数显著减少(P<0.05),线粒体肿胀空泡化,培养液LDH含量明显上升(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13、APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均下调(P<0.05)。与Bup组比较,BAp组细胞搏动次数显著增加(P<0.05),线粒体结构明显改善,培养液LDH含量明显下降(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13,APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均上调(P<0.05)。结论:(Pyr1)Apelin-13可逆转布比卡因诱导的心肌细胞停搏,机制也许与激活PI3K/Akt蛋白磷酸化有关。

基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制

目的基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制。方法24只新西兰大白兔被随机分为正常对照组、模型组、蛇伤胶囊组,每组8只雌雄各半,根据前期研究方法模型组和蛇伤胶囊组以兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg竹叶青蛇毒液,建立竹叶青蛇伤兔模型,正常对照组注射等量生理盐水。注射后6 h后予正常对照组和模型组以10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃,蛇伤胶囊组予10 ml/(kg·d)蛇伤胶囊所配药液灌胃。以上3组连续灌胃1周后兔耳缘静脉采血5 ml,血小板分离提取后Western blot检测各组血小板细胞PTEN、PI3K、Akt蛋白表达,qPCR检测各组血小板活化指标CD62P mRNA表达。结果与正常对照组相比,模型组血小板细胞PTEN蛋白表达增加(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达减少(P<0.01);与模型组相比,蛇伤胶囊组血小板细胞PTEN蛋白表达减少(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达增加(P<0.01)。结论蛇伤胶囊可通过上调PI3K/Akt通路,改善竹叶青蛇伤导致的血小板活化功能受抑制,从而治疗竹叶青蛇伤凝血障碍。

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^(-1))干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AKT基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。黄芪可能通过激活PI3K/AKT信号通路维持缺氧条件下BMSCs的增殖活性。