AKT/HIF/VEGF信号通路与p-NMDAR2B在难治性癫痫相关性FCD致痫灶中的作用及相关因素分析

目的研究AKT/HIF/VEGF信号通路与p-NMDAR2B在难治性癫痫相关性FCD致痫灶中的作用及相关因素分析,探讨两者在FCD致痫灶中的作用及相关因素分析。方法该研究于2010年1月—2015年1月间方便选取在福建医科大学附属第一医院神经外科进行手术治疗的50例难治性癫痫患者,所有患者均经术后病理证实为FCD,将术后病灶脑组织进行研究分析,作为实验组;其中FCDⅠ型30例,FCDⅡ型20例。同时另外选取50例行减压或清创手术的脑外伤患者,将术中获取的和各种病变患者手术入路不可避免要切除的正常脑组织进行研究,纳入对照组。均利用免疫组织化学染色和Western blot方法检测上述脑组织中的p-AKT1/2/3(Thr308)、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B(Tyr1336)的表达情况和蛋白水平。观察各型癫痫患者和正常脑组织p-AKT1/2/3(Thr308)、HIF-1、VEGF以及pNMDAR2B(Tyr1336)的表达情况、免疫组化积分情况以及β-actin灰度比值情况。结果 (1)各型难治性癫痫相关性FCD致痫灶中AKT/HIF/VEGF信号通路发生不同程度激活表现,属异常现象。(2)Western blot:p-AKT1/2/3(Thr308)、HIF-1、VEGF以及p-NMDAR2B(Tyr1336)在FCDⅠ型病灶中表达水平分别为(0.619 3±0.078 4)、(0.779 2±0.039 1)、(0.752 8±0.099 4)以及(0.641 4±0.091 9);在FCDⅡ型病灶中表达水平分别为(0.885 9±0.031 1)、(0.862 9±0.035 5)、(0.839 2±0.038 1)以及(0.908 8±0.037 3),均明显高于正常脑组织的(0.404 2±0.084 9)、(0.467 9±0.013 8)、(0.479 8±0.045 1)以及(0.349 2±0.090 7),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AKT/HIF/VEGF信号通路可能是通过调控NMDA受体活性参与了FCD相关难治性癫痫的发生发展。

VEGF/Akt信号通路在骨折大鼠愈合中作用机制及对炎症因子IL-6、TNF-α的影响

目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在骨折大鼠愈合中的作用机制及对炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响。方法 选取健康清洁级SD雄性大鼠30只,按随机原则分为假手术组、模型组与对照组,每组10只。其中假手术组行假手术,模型组与对照组建立大鼠股骨骨折模型,对照组通过尾静脉注射经慢病毒转染高表达VEGF的骨髓间充质干细胞处理。4 w后通过四点断裂实验分析愈合后股骨的力学参数,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中成骨标记物骨源性碱性磷酸酶(BALP)、IL-6与TNF-α水平,通过苏木素-伊红(HE)染色观察股骨标本病理学变化,通过RT-聚合酶链反应(PCR)检测VEGF与p-Akt水平,通过Western印迹检测骨痂组织中p-Akt、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6、TNF-α蛋白水平。结果 对照组骨折部位承受的最大力及韧性均显著高于模型组(P<0.05)。对照组外周血中BALP水平显著高于模型组,IL-6与TNF-α水平显著低于模型组(P<0.05)。与模型组相比,对照组骨折部位能观察到广泛的新骨生成,且骨组织中VEGF、p-Akt mRNA水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比,对照组骨痂组织中eNOS与p-Akt蛋白表达显著上调,IL-6与TNF-α蛋白表达显著下调(P<0.05)。结论 激活VEGF/Akt信号通路能促进骨折大鼠的愈合,且能够抑制炎症反应。

红景天对尾吊小鼠眼压、视网膜结构及PI3K/AKT/HIF⁃1α信号通路的影响

针对微重力环境导致的航天相关眼综合征存在眼压升高与视网膜病变问题,研究红景天对尾吊小鼠眼压、视网膜结构的影响及作用机制。实验取55只C57小鼠,分为5组,每组11只,经2周造模,4周给药干预,历时6周;第2、4、6周测量小鼠眼压,6周后HE染色观察小鼠视网膜结构,RT⁃PCR测定小鼠视网膜内PI3K、AKT、HIF⁃1α基因表达水平。结果显示:尾吊模拟微重力状态下,小鼠眼压4周显著性高(P<0.01),6周时出现自然回落;6周小鼠视网膜结构未发生明显病理性改变,视网膜内PI3K、AKT、HIF⁃1α基因表达水平显著升高(P<0.05);应用红景天干预,可有效降低尾吊小鼠4周时的眼压(P<0.01),调节6周时视网膜内PI3K、AKT、HIF⁃1α基因表达水平(P<0.05);高剂量红景天干预造成6周时小鼠眼压较空白组显著升高(P<0.05)。红景天可降低尾吊小鼠的眼压升高,调节小鼠PI3K/AKT/HIF⁃1α信号通路表达水平,低剂量红景天干预安全性更佳。

基于网络药理学和动物实验探讨化铁丸通过PI3K/Akt信号通路防治前列腺增生的作用

目的探究化铁丸防治前列腺增生(BPH)的作用及其机制。方法通过皮下注射丙酸睾酮构建BPH大鼠模型,造模4周同时给药干预,检测前列腺、精囊、提肛肌、睾丸、附睾指数,并通过HE染色观察前列腺组织病理变化,ELISA试剂盒检测睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、雌二醇(E2)、前列腺特异性抗原(PSA)水平。借助TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction数据库筛选化铁丸有效成分及靶点,GeneCards、OMIM、TTD等数据库筛选BPH疾病靶点,交集靶点借助STRING数据库及Cytoscape3.9.0软件筛选靶点,并进行GO、KEGG富集分析,结合文献确认核心靶点,CB-Dock2对质谱-网络药理学交集成分与核心靶点进行对接验证,Westernblot和RT-qPCR法检测前列腺PCNA、α-SMA、AR、VEGF、PI3K、Akt、Bax、Bcl-2表达。结果与模型组比较,化铁丸高剂量组(2.7g/kg)前列腺指数降低(P<0.01),而精囊、提肛肌、睾丸、附睾指数无明显变化(P>0.05),前列腺组织病理状态得到改善;T、DHT、E2、E2/T、PSA水平降低(P<0.05,P<0.01)。TCMSP等数据库筛选出化铁丸活性成分20个、靶点377个,GeneCards等数据库筛选出BPH靶点497个、交集靶点65个。GO分析显示,生物途径包括内类固醇激素受体信号通路、细胞凋亡等,作用蛋白定位在细胞核、核浆、胞浆等上,分子功能包括雌激素反应元件结合、类固醇结合等。KEGG富集显示,相关信号通路有PI3K-Akt、VEGF、雌激素等,结合文献,确认核心靶点VEGF、BFGF、Akt、PI3K、Bax、Bcl-2。分子对接显示,质谱-网络药理学交集成分与核心靶点结合紧密。Westernblot和RT-qPCR显示,化铁丸高剂量组可下调PCNA、α-SMA、AR、VEGF、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2表达,上调ERβ、Bax表达(P<0.05,P<0.01)。结论化铁丸通过调节BPH大鼠性激素水平紊乱及性激素受体表达,并激活PI3K-Akt通路促进细胞凋亡,从而抑制BPH。

银杏叶提取物通过VEGF/PI3K/Akt1信号通路改善大鼠创伤性脑水肿

目的观察银杏叶提取物(EGb761)治疗大鼠急性创伤性脑水肿的效果,探讨其可能机制。方法将64只SD大鼠随机分至假手术组(A组)、创伤性脑损伤(TBI)+等剂量生理盐水组(B组)、TBI+低剂量EGb761(C组)、TBI+高剂量EGb761(D组)各16只。采用Feeney自由落体致伤法建立大鼠顶叶局灶皮质挫裂伤模型,其中C组和D组,在创伤1 h后,分别给予EGb761(25、50 mg/kg)处理。采用干湿重法检测脑组织含水量,超氧化物阴离子荧光探针(DHE)染色观察氧自由基表达水平,Western印迹检测血管内皮生长因子受体(VEGFR)2、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)1和基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达水平。结果与A组相比,B、C、D组均出现脑水肿,氧自由基、VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9表达水平明显上升(P<0.05);与B组相比,C组和D组在EGb761处理后脑水肿程度明显改善(P<0.05);且D组比C组显著降低(P<0.05)。结论EGb761能有效改善创伤性脑水肿,且有剂量依赖性,其机制可能是通过清除氧自由基,降低VEGFR2、PI3K、Akt1和MMP-9的表达水平。

基于HIF-1α/VEGF通路探讨土家族麝针疗法“活血生新”干预缺血性脑卒中大鼠的作用机制

目的 探讨土家族麝针疗法对缺血性脑卒中大鼠运动功能的康复作用,分析缺氧诱导因子(HIF)-1α/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路在缺血性脑卒中发生、发展和转归中的作用机制。方法 采用改良线栓法复制缺血性脑中风大鼠模型。筛选Zea-longa评分为1~3分的大鼠,随机分为模型组、土家族麝针组、针刺组,另设立假手术组,每组15只,土家族麝针组以自制麝针刺激大鼠对侧头皮运动区肌层;针刺组以普通针灸同法治疗,持续治疗3个疗程。假手术组和模型组不做任何处理。在治疗前和每个疗程治疗结束后,每组随机选取6只大鼠进行平衡木实验检测其神经运动功能变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中的VEGF和HIF-1α含量;Western印迹检测海马中VEGF受体(VEGFR)2与酪氨酸蛋白激酶家族成员(Src)蛋白的表达。结果 治疗前,与假手术组相比,模型组、土家族麝针组和针刺组运动功能明显降低,血浆中VEGF和HIF-1α含量明显增高(P<0.05);治疗3个疗程后,与模型组比较,麝针组和针刺组的运动功能明显提高,血浆中HIF-1α和VEGF含量明显升高,大鼠海马中VEGFR2相对表达量明显升高,Src蛋白相对表达量明显降低(P<0.05);与针刺组相比,麝针组神经运动功能恢复明显较好,血浆中VEGF和HIF-1α含量明显高于针刺组(P<0.05)。麝针组海马中VEGFR2相对表达明显升高,Src蛋白相对表达明显降低(P<0.05)。结论 土家族麝针疗法对缺血性脑卒中所致运动功能障碍的康复有明显促进作用,可能是通过调节HIF-1α/VEGF信号通路以“活血化瘀生新”而实现的。

基于VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路探讨木犀草素干预A型流感病毒的作用机制

目的探讨木犀草素对A型流感病毒(influenza A virus,IAV)感染的小鼠肺上皮细胞损伤模型的作用机制。方法将小鼠肺上皮MLE-12细胞分为正常组、模型组、奥司他韦组、高剂量组和低剂量组,除正常组外,其余4组均使用IAV感染,正常组加入等量病毒稀释液;2 h后弃病毒工作液,正常组和模型组加入病毒维持液,药物组加入用病毒维持液稀释的药物工作液,干预8 h后收集细胞。使用CCK-8检测细胞增殖情况;ELISA实验检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫荧光检测细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达情况;RT-qPCR技术检测细胞内VEGF、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达情况;Western blot法检测细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS蛋白表达情况。结果CCK-8结果显示,不同浓度的木犀草素均能降低IAV感染所致的细胞损伤(P<0.01),其EC50值为7.204μmol/L,因此,将后续实验中的木犀草素药物浓度定为5μmol/L和2.5μmol/L。与正常组相比,模型组细胞上清液中TNF-α和IL-6升高(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度增强(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达升高(P<0.01);与模型组相比,高剂量组和低剂量组细胞上清液中TNF-α和IL-6降低(P<0.01),细胞内VEGF的荧光蛋白强度减弱(P<0.01),细胞内VEGF、Akt、PI3K和eNOS的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.01)。结论木犀草素能抑制炎性细胞因子的分泌,缓解IAV感染所致的细胞损伤,其过程可能与VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

外源性Apelin-13通过调控VEGF/PI3K/Akt信号通路促进大鼠股骨骨折愈合

目的探讨Apelin-13调控VEGF/PI3K/Akt信号通路对大鼠股骨骨折愈合的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分成假手术组(sham组)、模型组(Model组)、Apelin-13低剂量组[Apelin-13 L组,25μg/(kg·d)]和Apelin-13高剂量组[Apelin-13 H组,75μg/(kg·d)],每组10只。建立大鼠股骨骨折模型,立即给予相应药物处理,治疗4周。采用Micro CT和X射线分别检测各组大鼠股骨显微参数和骨痂直径;苏木精-伊红(HE)染色观察骨组织病理变化;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中成骨标记物骨源性碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)和破骨标记物抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)、Ⅰ型胶原C端肽(CTX)表达水平;qRT-PCR检测骨痂组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA表达水平;Western blot检测骨痂组织中VEGF/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平。结果与sham组比较,Model组大鼠股骨病理损伤较严重,股骨骨密度、组织矿物质密度、骨体积分数和X射线评分均降低,血清中BALP和PINP水平降低,而TRACP-5b、CTX含量均增加,骨痂组织中VEGFA mRNA以及VEGFA、VEGFR2、PI3K p85、p-Akt等蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Apelin-13 H组大鼠股骨病理损伤改善明显,股骨骨密度、组织矿物质密度、骨体积分数、X射线评分和骨痂直径均增加,血清中BALP和PINP含量增加,TRACP-5b和CTX含量减少,骨痂组织中VEGFA mRNA以及VEGFA、VEGFR2、PI3K p85、p-Akt蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.05),而Apelin-13 L组与Model组比较,相关指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论外源性Apelin-13可促进大鼠股骨骨折愈合,其机制可能与VEGF/PI3K/Akt信号通路的激活有关。

电针井穴对VD大鼠海马CA1区PI3K/Akt/mTOR通路及VEGF、bFGF的影响

目的探讨电针井穴改善VD大鼠记忆及对VD大鼠海马CA1区PI3K/Akt/mTOR信号通路及对细胞生长因子VEGF、bFGF表达的调节作用。方法用4-VO(四血管阻断法)制备VD大鼠模型,将大鼠随机分为电针组(VD+Z组)、西药组(VD+Y组)、VD对照组(VD组)、假手术组(BG组)。以水迷宫试验、神经行为学评分对全部治疗后大鼠的学习记忆能力进行评分;采用免疫组化、Western blot检测各组海马CA1区PI3K、Akt、mTOR、VEGF、bFGF的表达情况。结果与VD组相比,VD+Z组、VD+Y组的水迷宫实验逃避潜伏期、跨越平台、神经行为学评分显著好转(P<0.01);VD+Z组、VD+Y组CA1区PI3K、Akt、mTOR、VEGF、bFGF的各项表达均显著升高(P<0.01)。结论电针相关井穴可激活海马CA1区PI3K/Akt/mTOR信号通路及VEGF、bFGF表达,促进血管再生,进而有效提高学习记忆功能以改善VD。

祛腐生肌外治法对糖尿病溃疡大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其相关信号通路影响的meta分析和系统评价

目的:系统评价中药外用祛腐生肌法对糖尿足溃疡(DFU)大鼠模型血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其相关信号通路的影响并进行Meta分析。方法:在中国知网、万方、PubMed等数据库进行文献检索,检索时间自建库至2022年4月。根据SYRCLE的偏倚风险工具对每一篇纳入文献的研究质量进行评价。使用Review Manager 5.4.1软件根据Cochrane系统评价方法进行Meta分析。结果:包括508只大鼠的19项研究,纳入研究的质量分数都在3~5分。Meta分析结果显示,无论是促进糖尿病溃疡大鼠创面组织中VEGF蛋白表达、增加创面组织中VEGF mRNA水平还是提高大鼠血清中VEFG因子含量,与对照组相比,祛腐生肌治疗组都具有明显的优势[SMD=1.39,95%CI(0.67,2.10),P=0.0002;SMD=5.53,95%CI(0.58,10.11),P=0.03;SMD=1.91,95%CI(0.73,3.09),P=0.002]。亚组分析显示,当对照组为常规换药组时,中药外用促进创面组织中VEGF蛋白表达的优势明显[SMD=2.02,95%CI(1.27,2.78),P=0.0002;SMD=2.06,95%CI(0.16,3.96),P=0.03],当对照组为生长因子换药组时,尚不能证明二者在促进创面组织中VEGF蛋白表达方面有差异[SMD=0.04,95%CI(-0.52,0.61),P=0.88]。同时研究表明,中药外用可能是通过调控HIF-1/VEGF/VEGFR-2信号通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt/β-catenin信号通路中的上下游分子的表达,从而影响尿病溃疡大鼠创面组织及血清中VEGF的表达水平,这些分子包括HIF-1α[SMD=2.35,95%CI(1.11,3.59),P=0.0002]、VEGFR-2[SMD=4.52,95%CI(0.63,8.42),P=0.02]、PI3K[SMD=-0.94,95%CI(-1.08,-0.80),P=0.00001]、AKT[SMD=0.28,95%CI(0.22,0.34),P<0.00001]、β-catenin[SMD=0.23,95%CI(0.19,0.27),P<0.00001]、GS3K-β[SMD=0.44,95%CI(0.06,0.82),P=0.02]、Cym-c[SMD=-0.47,95%CI(-0.72,-0.22),P=0.0002]。结论:中药外用祛腐生肌法治疗DFU大鼠创面与其促进VEGF在创面和血清中的表达相关,其机理可能与影响HIF-1α/VEGF/VEGFR-2、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT等信号通路的上下游分子有关,但仍需更多的大样本、高治疗、设计更合理的实验来进一步验证。

水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞表达VEGF

目的:研究水蛭提取液对视网膜母细胞瘤细胞(WERI-RB-1细胞)表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响及相关分子机制。方法:将体外培养的WERI-RB-1细胞分为对照组、0.04U/mL水蛭提取液组、0.08U/mL水蛭提取液组,对照组采用完全培养基培养48h,水蛭提取液组分别采用含0.04、0.08U/mL含药培养基培养48h。采用ELISA法检测各组细胞培养基上清液中VEGF表达水平;采用RT-PCR法检测各组细胞缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA相对表达水平;采用Western Blot法检测各组细胞HIF-1a、MMP-9、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、人磷酸化蛋白激酶(p-AKT)相对表达水平。结果:与对照组比较,水蛭提取液组细胞培养基上清液中VEGF表达均降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对VEGF表达抑制率分别为32.43%、38.92%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a和MMP-9 mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a mRNA表达抑制率分别为27.64%、24.75%,对MMP-9 mRNA表达抑制率分别为43.97%、51.48%。与对照组比较,水蛭提取液组细胞HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白相对表达水平均明显降低(P<0.05),0.04、0.08U/mL水蛭提取液对HIF-1a蛋白表达抑制率分别为55.81%、43.85%,对MMP-9蛋白表达抑制率分别为39.49%、47.23%,对PI3K蛋白表达抑制率分别为33.27%、29.83%,对p-AKT蛋白表达抑制率分别为52.07%、30.21%。结论:水蛭提取液可能通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9因子抑制WERI-RB-1细胞VEGF的表达。

欧前胡素调节HIF-1α/VEGF信号通路对膀胱癌细胞上皮间质转化和血管生成的影响

目的探讨欧前胡素(IMP)调节缺氧诱导因子(HIF)-1α/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路对膀胱癌(BC)细胞上皮间质转化(EMT)和血管生成的影响。方法实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1和BC细胞5637、UM-UC-3、T24中HIF-1α、VEGF mRNA表达水平;以UM-UC-3细胞为研究对象,设置对照组(不进行处理)、IMP低、中、高浓度(10、20、40μmol/L IMP,IMT-L、IMP-M、IMP-H)组、IMP-H+HIF-1α/VEGF信号通路激活剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)组(40μmol/L IMP+10μmol/L DMOG)。48 h后,噻唑蓝(MTT)法检测UM-UC-3细胞增殖率;血管形成实验检测人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成能力;qRT-PCR检测各组UM-UC-3细胞中以上指标水平;Western印迹检测EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)及HIF-1α、VEGF蛋白表达;Transwell分析细胞迁移和侵袭。结果5637、UM-UC-3、T24细胞中上述指标表达水平较SV-HUC-1均显著增加,且UM-UC-3细胞中HIF-1α、VEGF mRNA表达变化最显著(P<0.05)。与对照组相比,IMP-L组、IMP-M组、IMP-H组E-cadherin表达显著增加,增殖率、迁移和侵袭、管道交叉点数、N-cadherin、Vimentin蛋白表达及HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05);与IMP-H组相比,IMP-H+DMOG组E-cadherin表达显著降低,增殖率、迁移和侵袭、管道交叉点数、N-cadherin、Vimentin蛋白表达及HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论IMP通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路阻止UM-UC-3细胞增殖、迁移、侵袭、EMT及血管生成。

滋肾育胎丸对RSA小鼠蜕膜组织VEGF/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨滋肾育胎丸对RSA小鼠蜕膜组织VEGF/PI3K/Akt信号通路中相关蛋白表达的影响。方法:取正常妊娠模型CBA×BALB/c小鼠8只作为正常组,RSA模型成功的CBA/J×DBA/2小鼠24只,按妊娠顺序随机分为模型组和黄体酮胶囊对照组和滋肾育胎丸组,每组动物数均为8只。其中正常妊娠组、模型对照组分别予以蒸馏水灌胃,黄体酮胶囊组和滋肾育胎丸组分别给予相应药物灌胃,连续15天,末次给药24h后,颈椎脱臼处死孕鼠,观察子宫和各组小鼠胚胎丢失率;取其子宫蜕膜组织,HE染色观察子宫蜕膜组织变化,蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)检测蜕膜组织VEGF、MVD、PI3K、AKT、p-AKT和HIF-1α蛋白的表达。结果:与模型组RSA小鼠相比,黄体酮胶囊组(156mg/kg)和滋肾育胎丸组(11.7g/kg)的胚胎丢失率显著降低,子宫蜕膜组织病变明显减轻;蜕膜组织的VEGF、MVD、PI3K、AKT、p-AKT和HIF-1α蛋白的表达显著升高,而ES蛋白则显著降低。结论:滋肾育胎丸改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生与调控VEGF/PI3K/Akt通路蛋白表达有关。

阿帕替尼对乳腺癌MCF-7细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平和VEGF自分泌作用的研究

目的探讨阿帕替尼(apatinib)对乳腺癌MCF-7细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平及VEGF自分泌作用的影响。方法利用MTT法研究不同剂量阿帕替尼对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖作用;采用Transwelll小室和划痕实验分别检测阿帕替尼对MCF-7细胞侵袭、迁移能力的影响;采用流式细胞术检测乳腺癌MCF-7细胞凋亡情况;利用Western blot方法检测不同剂量阿帕替尼对MCF-7细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白,Bcl-2家族和caspase家族蛋白及VEGF相关调控蛋白表达的影响。结果MTT检测发现不同剂量阿帕替尼处理后的MCF-7细胞生长受到显著抑制,且表现出明显的剂量依赖性(P<0.001),其半数抑制浓度为319.12nM;Transwell小室和划痕实验结果表明阿帕替尼处理后MCF-7细胞的侵袭能力和迁移能力表现出明显的剂量依赖性抑制(P<0.01);流式细胞术表明阿帕替尼能够诱导人MCF-7细胞发生剂量依赖性细胞凋亡(P<0.001);Western blot结果显示阿帕替尼能够抑制MCF-7细胞PI3K、p-AKT、mTOR、Bcl-2的表达量(P<0.05),上调促凋亡蛋白Bad、cleaved-caspase-3表达(P<0.05);同时阿帕替尼能够抑制VEGF和MMP-9的表达,下调VEGFR2的表达和磷酸化(P<0.05)。结论阿帕替尼能够通过PI3K/Akt信号通路,诱导细胞凋亡,并通过抑制VEGF自分泌作用,抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖。

基于VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt信号通路研究健脾活骨方对酒精性股骨头坏死血管损伤的修复作用机制

目的:本研究旨在观察健脾活骨方(JPHGP)对实验性酒精性股骨头坏死(AONFH)血管损伤的修复作用,并基于血管内皮细胞生长因子(VEGF)/血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路探索其作用机制。方法:实验采用46%酒精度红星二锅头10 m L·kg^(-1)·d^(-1)灌胃建立AONFH大鼠模型,观察JPHGP不同剂量组(2.5、5.0、10.0 g·kg^(-1))的干预作用,选择健骨生丸(JGS,1.5 g·kg^(-1))为阳性药物;给药8周后,Micro-CT扫描分析股骨头骨计量学,墨汁灌注观察股骨头骨髓内微血管面积,苏木素-伊红(HE)染色法观察病理学改变程度,免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测股骨头中血小板-内皮细胞黏附分子31(CD31)、VEGF、VEGFR2、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Ak)和抑癌基因(PTEN)的蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠股骨头骨小梁断裂变细,空骨陷窝增多,脂肪细胞数量明显增多和直径显著变大(P<0.01),Micro-CT影像学结果显示骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)均明显降低(P<0.05,P<0.01),骨表面积体积比(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)均显著升高(P<0.01),墨汁灌注结果表明股骨头髓腔内微血管面积显著减少(P<0.01);与模型组比较,JPHGP作用后能降低AONFH大鼠股骨头的空骨陷窝率、脂肪细胞面积和直径,Micro-CT影像学结果显示JPHGP低剂量组BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显升高(P<0.05,P<0.01),BS/BV显著降低(P<0.01),BMD呈升高趋势,Tb.Sp呈下降趋势,但差异均无统计学意义,JPHGP中、高剂量组的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显升高(P<0.05,P<0.01),BS/BV、Tb.Sp明显降低(P<0.05,P<0.01),并明显升高股骨头髓腔内微血管面积(P<0.05,P<0.01),扩大股骨头髓腔内微血管面积;与正常组比较,模型组大鼠均显著下调CD31、VEGF、VEGFR2、PI3K、p-Akt和上调PTEN的表达含量(P<0.01),与模型组比较,JPHGP作用后中、高剂量组显著升高大鼠股骨头CD31、PI3K、p-Akt表达含量(P<0.01),降低PTEN蛋白的表达水平(P<0.01),同时JPHGP作用后上调VEGF、VEGFR2表达含量(P<0.05,P<0.01)。结论:JPHGP对AONFH股骨头血管损伤具有修复作用,其机制可能与激活VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt信号通路有关,相关研究结果将为JPHGP的临床应用提供一定科学依据和参考。

基于PI3K/Akt/NF-κB途径探究补肾活血方治疗子宫内膜异位症的作用机制研究

[目的]探究补肾活血方(BSHXR)治疗子宫内膜异位症(EMS)的作用机制。[方法]采用自体子宫内膜移植术建立EMS大鼠模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、BSHXR高、中、低剂量组、LY294002(PI3K抑制剂)组,每组10只。给药28 d后,测定大鼠异位子宫内膜病灶体积,苏木精-伊红(HE)染色观察异位子宫内膜组织病理变化,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的水平,免疫组化染色检测异位子宫内膜组织血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)表达,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测异位子宫内膜组织血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA水平,Western blot法检测异位内膜组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子κB(NF-κB)通路蛋白表达水平。[结果]与假手术组比较,EMS大鼠异位子宫内膜病灶体积显著增加,血清炎症因子水平升高,CD31阳性细胞数量增加,VEGF、MMP-9 mRNA水平升高,PI3K/Akt/NF-κB信号通路被活化(P<0.05)。与模型组比较,BSHXR可缩小大鼠异位子宫内膜病灶体积,降低血清炎症因子水平,减少CD31阳性细胞数量,降低VEGF、MMP-9 mRNA表达水平,抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路活化,其作用呈剂量依赖性(P<0.05)。[结论]BSHXR对大鼠EMS具有治疗作用,其作用机制与抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路活化有关。

基于网络药理学方法及实验验证探讨复方金钱草颗粒对前列腺增生的防治作用及机制

目的基于网络药理学方法及实验验证探讨复方金钱草颗粒(JQC)对前列腺增生(BPH)的防治作用及机制。方法(1)通过TCMSP数据库检索广金钱草、车前草、光石韦、玉米须的活性成分,同时通过文献检索进行补充;利用PubChem、Swiss Target Prediction、CTD数据库筛选JQC活性成分作用靶点。通过GeneCards、CTD、DRUGBANK、DisGeNET数据库筛选BPH疾病相关靶点。对JQC活性成分作用靶点与BPH疾病相关靶点进行映射取交集,即得JQC治疗BPH的潜在作用靶点。利用STRING 11.5数据库对JQC治疗BPH的潜在作用靶点进行蛋白互作(PPI)网络分析。利用Metascape平台对潜在作用靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。采用Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-成分-靶点-通路”网络,预测JQC治疗BPH的关键活性成分及核心靶点。利用AutoDock Vina软件进行关键活性成分与核心靶点的分子对接验证。(2)将60只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、前列舒通胶囊组(0.324 g·kg^(-1))及JQC高、中、低剂量组(3.24、1.62、0.81 g·kg^(-1)),每组10只。采用去势联合注射丙酸睾酮诱导建立BPH大鼠模型。灌胃给药,每天1次,连续给药30 d。摘取大鼠前列腺组织,称定质量并计算前列腺湿质量指数;采用ELISA法检测血清COX-2、VEGF、PGE2的含量;HE染色法观察大鼠前列腺组织的病理变化;Western Blot法检测前列腺组织中AKT1、p-AKT1、PI3K、p-PI3K、COX-2、VEGF蛋白表达水平。结果(1)共得到JQC活性成分作用靶点260个,疾病相关靶点1584个,JQC治疗BPH的潜在作用靶点(交集靶点)125个。PPI网络分析发现AKT1、TNF、TP53、IL1β、EGFR、CASP3、PTGS2等靶点可能是JQC治疗BPH的重要靶点。JQC治疗BPH的潜在作用靶点主要与IL-17、HIF-1、TNF及PI3K-Akt通路相关。得到关键活性成分为木犀草素、芹菜素、车前子苷、芒果苷、夏佛塔苷、异牡荆苷,核心靶点为PTGS2、AR、CASP3、IL6、PTGS1、AKT1等。共有24对“关键活性成分-核心靶点”的分子结合能均≤-6 kcal·mol^(-1);PTGS2蛋白受体与木犀草素、芹菜素等配体结合活性最好;AKT1与车前子苷、芒果苷、木犀草素、芹菜素、夏佛塔苷、异牡荆苷等均具有较好的亲和力。(2)与模型组比较,JQC高、中剂量组大鼠的前列腺湿质量与湿质量指数均明显降低(P<0.05,P<0.01);大鼠前列腺腺体基底细胞肥大有明显缓解,腺腔大小相对规则,上皮细胞增生情况均有所改善;血清COX-2、VEGF、PGE2水平明显降低(P<0.05,P<0.01);前列腺组织中的p-AKT1、p-PI3K、PI3K、COX-2、VEGF蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论JQC对BPH具有明显防治作用,其机制可能是通过车前子苷、芒果苷、木犀草素等活性成分来调控PI3K/Akt信号通路,抑制COX-2的表达,减少PGE2释放,进而导致VEGF表达下调,抑制前列腺细胞增殖。

补肾活血方通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路改善DOR大鼠卵巢储备功能

目的:观察补肾活血方调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关因子改善卵巢储备功能下降(DOR)大鼠卵巢储备功能的作用机制。方法:运用Ataya法腹腔注射环磷酰胺复制60只DOR模型大鼠,将其随机分为模型组、戊酸雌二醇组(0.000 9 g·kg^(-1)),补肾活血方高、中、低剂量组(33,16.5,8.25 g·kg^(-1)),同时另设正常组,每组12只;各组相应药物治疗,正常组和模型组给予等体积生理盐水,连续灌胃14 d,每天1次。治疗结束后,苏木素-伊红(HE)染色卵巢组织,光镜观察初级卵泡数、成熟卵泡数、总卵泡数的变化;免疫组化检测卵巢组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织中PI3K,Akt,mTOR,半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测卵巢组织中PI3K,Akt,mTOR mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组卵巢组织中成熟卵泡数量、总卵泡数量明显减少(P<0.05,P<0.01),卵巢组织中VEGF,Caspase-3表达升高(P<0.05),PI3K,Akt,mTOR蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,补肾活血方中、高剂量组成熟卵泡数量、总卵泡数量均有不同程度上升(P<0.05,P<0.01),VEGF补肾活血方中剂量组升高最为明显(P<0.05),补肾活血方低、中、高剂量组及戊酸雌二醇组Caspase-3下降,补肾活血方中、高剂量组PI3K,Akt,mTOR蛋白及mRNA表达水平均升高(P<0.05,P<0.01),且补肾活血方中剂量组更加接近于正常组。结论:补肾活血方可以有效地改善DOR大鼠卵巢储备功能,促进卵泡数量增加。作用机制可能与补肾活血方通过增加卵巢组织中VEGF的表达有关,进而激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,从而调节Caspase-3的含量,最后促进卵泡数量的增加。

丹栀逍遥散加减对肝郁气滞型新生血管性青光眼的临床应用及机制探讨

目的:观察丹栀逍遥散加减对肝郁气滞型新生血管性青光眼的临床疗效及其与HIF-1/VEGF/Notch1信号通路相关性探讨。方法:将42例肝郁气滞型新生血管性青光眼患者随机分成2组,治疗组给予丹栀逍遥散加减+降眼压药物口服,对照组予降眼压药物,观察2组治疗4周后眼压、视力、视野、新生血管回退情况等;应用Western Blot检测2组患者血清中HIF-1a、VEGF、Notch1蛋白表达情况。结果:2组经不同方法治疗4周后眼压、视力、视野、新生血管情况比较有统计学意义(P<0.05),治疗组经丹栀逍遥散加减口服治疗与对照组比较,HIF-1a、VEGF、Notch1的蛋白表达情况明显低于对照组,且有统计学意义(P<0.05)。结论:丹栀逍遥散加减治疗新生血管性青光眼可以有效控制眼压,提高视力、视野,促使新生血管消退,是一种安全有效的治疗方式,值得临床推广应用,其作用机制可能是通过调控HIF-1/VEGF/Notch信号通路来实现的。

bFGF通过促进心脏血管新生改善心肌梗死后小鼠心脏重构

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)对心肌梗死小鼠心脏的保护作用及机制。方法:采用异氟烷麻醉C57/B6小鼠(8~12周龄)后,侧开胸结扎冠状动脉左前降支,建立小鼠心肌梗死模型;设立假手术组为对照,心肌梗死模型小鼠随机分为心梗组和bFGF给药组,其中bFGF组小鼠心梗7d后给予5μg b FGF隔天腹腔注射给药;在小鼠心梗第28天时采用心脏多普勒超声检测心功能,以左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左心室射血分数和左心室短轴缩短分数评价心脏功能改变;28 d后处死小鼠,行病理切片观察心肌纤维化程度和心肌梗死区内血管新生的情况;Western blot检测血管新生指标。结果:bFGF给药组小鼠心肌纤维化程度较心梗模型组明显减少;第28天行超声心动图检查结果示,心梗组小鼠心功能较假手术组差,而bFGF给药组小鼠心功能与心梗组比较有明显的改善;小鼠心肌病理切片免疫荧光观察结果发现,bFGF给药组心肌梗死区的新生血管比心梗组明显增多;Western blot实验表明,bFGF能够激活AKT/HIF-1α/VEGF通路。结论:隔天腹腔注射bFGF能够减少心肌梗死小鼠心肌纤维化,改善心功能。bFGF可能通过AKT/HIF-1α/VEGF信号通路促进血管新生,从而保护心脏。