鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。

木瓜总三萜通过调节miR-10a和PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路诱导胃癌细胞凋亡

目的:通过观察木瓜总三萜对人胃癌HGC-27细胞株生长的抑制作用,探寻其可能的作用机制。方法:将HGC-27细胞分别单用木瓜总三萜或同转染miR-10a mimic、PI3K抑制剂LY294002、mTOR抑制剂CCI-779及分别与木瓜总三萜联用处理后,采用MTT和JC-1法检测细胞活性和线粒体活性,实时定量PCR法检测miR-10a mRNA表达,Western blot法检测HGC-27细胞中PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白表达及其磷酸化。结果:木瓜总三萜可显著降低HGC-27细胞活性和线粒体活性,促进细胞凋亡;上调miR-10a mRNA表达,下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达及降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K比值(P<0.05)。结论:木瓜总三萜具有抑制人胃癌HGC-27细胞线粒体活性和细胞增殖的作用,其机制可能与促进miR-10a表达,抑制PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路激活有关。

胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬的研究

目的:研究胡桃醌通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬,发挥其抗肺癌作用的机制。方法:MTT法检测胡桃醌对A549细胞存活率的影响。透射电镜和细胞自噬染色检测试剂盒(MDC)观察胡桃醌诱导A549细胞自噬。蛋白免疫印迹法检测自噬标志蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ和LC3I蛋白和自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K相关蛋白的表达水平。RT-PCR法检测A549细胞中Beclin-1和LC3ⅡmRNA表达水平。结果:MTT结果表明胡桃醌抑制A549细胞增殖,IC 50=10μmol/L;透射电镜和MDC实验发现胡桃醌可以诱导A549细胞产生自噬;与对照组相比,胡桃醌可以显著增加Beclin-1蛋白表达水平、LC3Ⅱ/LC3I比值和Beclin-1、LC3ⅡmRNA表达水平(P<0.05,P<0.01);胡桃醌干预后,与对照组相比,Akt、mTOR和p70S6K蛋白的表达水平基本不变,但Akt、mTOR和p70S6K磷酸化蛋白的表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:胡桃醌可能通过Akt/mTOR/p70S6K通路调控肺癌细胞A549自噬。

利多卡因通过调控miR-520a/AKT/mTOR/p70S6K通路对SH-SY5Y细胞自噬的影响

目的探讨利多卡因通过调控自噬对神经毒性的影响及相关分子机制。方法培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y,MTT实验和乳酸脱氢酶(LDH)测定检测利多卡因对SH-SY5Y细胞活力和毒性的影响;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-520a的相对表达;Western blot检测利多卡因对AKT/mTOR/p70S6K通路相关蛋白和自噬相关蛋白的影响;细胞免疫荧光染色评估LC3B的表达;生物信息学预测AKT1是miR-520a的潜在靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-520a和AKT1之间的相互作用。结果与对照组比较,SH-SY5Y细胞活力受到明显的抑制,且呈时间和剂量依赖性,LDH的释放量随利多卡因剂量增多而增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达显著升高,p62蛋白表达显著降低,LC3B的荧光强度显著增强,miR-520a的表达显著增加,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著降低(P<0.05)。与NC inhibitor组比较,miR-520ainhibitor组WT-AKT1的荧光素酶活性显著升高(P<0.05),而MUT-AKT1的荧光素酶活性没有变化(P>0.05)。与利多卡因组+NC inhibitor组比较,利多卡因+miR-520a inhibitor组SH-SY5Y细胞中miR-520a水平降低,LDH的释放量显著降低,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达均显著升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表达显著降低,p62蛋白表达显著升高,LC3B的荧光强度显著降低(P<0.05)。结论利多卡因通过上调miR-520a的表达和抑制AKT/mTOR/p70S6K信号通路促进神经细胞自噬。

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增殖活性升高,细胞凋亡率降低,细胞中synaptopodin、podocin、nephrin、LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达量升高,P62蛋白表达量、p-mTOR/mTOR和p-P70S6K/P70S6K比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:KLF4通过激活足细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤,其作用机制可能与调控mTOR/P70S6K信号通路有关。

欧前胡素调节MAPK/mTOR/p70S6K信号通路对急性髓系白血病细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨欧前胡素(IMP)对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学行为的影响以及对MAPK/mTOR/p70S6K信号通路的调节机制。方法将人AML细胞HL-60进行培养传代,并分为对照组(未处理组),ERK抑制剂组(PD98059组),IMP低、中、高剂量组,IMP高剂量+ERK激活剂组(IMP高+Cearoin组),每组均设置6个重复。MTT法检测IMP对HL-60细胞的毒性;MTT法、软琼脂克隆形成实验检测HL-60细胞的增殖活性;流式细胞仪术检测HL-60细胞凋亡;Transwell小室检测HL-60细胞迁移和侵袭能力;ELISA检测HL-60细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;Western blot检测通路相关蛋白及Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达。结果与未处理组比较,PD98059组和IMP低、中、高剂量组HL-60细胞的存活率、克隆形成数量、迁移和侵袭数量、促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及ERK1/2、mTOR、p70S6K磷酸化水平、Bcl-2表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ显著升高(P<0.05);与IMP高剂量组比较,IMP高+Cearoin组中ERK激活剂明显消除了IMP对上述指标的影响(P<0.05)。结论IMP可能通过抑制MAPK/mTOR/p70S6K信号通路,抑制AML细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞自噬和凋亡。

p-Akt-mTOR-p70S6K信号通路蛋白与卵巢癌临床病理特征及化疗耐药的相关性

目的:研究磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路中的p-Akt,mTOR和p70S6K 3种蛋白与卵巢癌临床病理特征及化学药物治疗(简称化疗)耐药的关系。方法:采用免疫组织化学方法检测18例卵巢癌化疗耐药和25例化疗敏感组织中p-Akt,mTOR和p70S6K蛋白的表达,分析这些蛋白与卵巢癌临床病理特征及化疗耐药的相关性。结果:p-Akt蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为77.14%,50.00%和66.67%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为73.33%和75.00%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为18.18%和93.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。mTOR蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为77.14%,100.00%和83.33%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为80.00%和78.57%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为27.27%和96.88%,差异有统计学意义(P<0.05)。p70S6K蛋白在卵巢浆液性癌、黏液性癌和子宫内膜样癌中的表达分别为80.00%,100.00%和100.00%,三者比较差异无统计学意义(P>0.05);在高、中分化和低分化癌中的表达分别为93.33%和78.57%,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);在I~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期中的表达分别为45.45%和96.88%,差异有统计学意义(P<0.05)。p-Akt蛋白在卵巢癌化疗耐药和敏感组织中的表达率分别为88.89%及64.00%;mTOR蛋白在耐药和敏感组织中的表达率分别为94.44%及68.00%;p70S6K蛋白在耐药和敏感组织中的表达率分别为100.00%及72.00%,3种蛋白在耐药组中的表达均高于敏感组(P<0.05)。结论:p-AktmTOR-p70S6K信号通路中的3种蛋白可能参与卵巢癌的侵袭和转移,这3种蛋白的表达上调可能与卵巢癌化疗耐药有关,在临床上可作为预测卵巢癌化疗耐药的标志。

PLIN5通过p-AKT/p70S6K信号通路对肺癌细胞增殖的抑制作用

目的检测PLIN5在肺癌中的表达情况及作用,探讨其与p-AKT/p70S6K信号通路的关系。方法通过检索数据库资料结合免疫组化染色,分别在mRNA和蛋白水平分析PLIN5在肺癌及癌旁正常组织中的表达差异。慢病毒感染过表达PLIN5和用siRNA敲低PLIN5在肺癌细胞系A549和NCI-H1299中表达后,CCK-8活力检测细胞增殖能力变化;比色法检测细胞ATP含量变化;流式细胞术检测活性氧含量变化;Western blot检测p-AKT/p70S6K信号通路相关蛋白变化。结果公共数据库资料和免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,在肺癌组织中PLIN5表达下调。过表达PLIN5后细胞增殖受到抑制,敲低PLIN5后细胞增殖能力上升。ATP含量检测显示PLIN5降低细胞内ATP含量水平。活性氧含量检测显示PLIN5上调细胞内活性氧含量水平。PLIN5降低p-AKT(Ser473),p-AKT(Thr308),p70S6K蛋白水平表达。结论PLIN5通过p-AKT/p70S6K信号通路在肺癌生长增殖中起抑制作用。

三邻甲苯磷酸酯染毒的母鸡脊髓中AKT/mTOR/p70S6K信号通路的变化

目的研究三邻甲苯磷酸酯(TOCP)所致迟发性神经病(OPIDN)中AKT/mTOR/p70S6K信号通路的变化,探讨OPIDN发生的分子机制。方法 30只成年罗曼母鸡随机分为5组,每组6只,给予750 mg/kg TOCP一次性灌胃,然后分别在TOCP染毒后0、1、5、10和21 d时间点处死一组动物取脊髓组织,免疫印迹法检测脊髓中AKT、p-AKT、p70S6K、p-p70S6K和mTOR的相对含量。结果 TOCP染毒引起母鸡脊髓中磷酸化AKT、p70S6K和mTOR的含量显著下降(P<0.05),而AKT、p70S6K的含量没有明显变化(P>0.05)。结论 TOCP干扰了AKT/mTOR/p70S6K信号通路的调节机制,这可能与OPIDN的发病机制有关。

中药肝复康对肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的干预作用

目的观察中药肝复康含药血清对乙醛刺激的肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的影响,以探讨肝复康抗纤维化的分子生物学机制。方法体外培养大鼠HSC-T6细胞,用肝复康对乙醛刺激的HSCs进行干预,采用RT-PCR法测定HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K的表达。结果空白对照组肝星状细胞各指标表达量呈相对较低水平,乙醛刺激组细胞Ⅰ型胶原、mTOR、P70S6K和Ⅲ型胶原表达量明显升高(P<0.05),而肝复康干预对于细胞Ⅰ型胶原、mTOR和P70S6K的升高有明显的抑制作用(P<0.01)。结论 mTOR/P70S6K信号通路在HSCs活化过程中起到重要作用,肝复康发挥抗纤维化的作用机制与阻断mTOR/P70S6K信号通路有关。

原发性胆囊癌组织中mTOR/p70S6K信号通路的表达及其临床病理学意义

目的探讨mTOR/p70S6K信号通路在原发性胆囊癌组织中的表达和临床意义。方法随机选取原发性胆囊癌患者86例,慢性胆囊炎患者15例,采用SABC免疫组化方法,检测胆囊癌组织和慢性胆囊炎症组织中mTOR及p70S6K蛋白的表达情况。并分析其与原发性胆囊癌组织临床病理学特征之间的关系。结果mTOR及p70S6K蛋白在原发性胆囊癌组织中的阳性表达率分别为77.91%(67/86)及80.23%(69/86),显著高于两者在慢性胆囊炎组织中的阳性表达率。两者在原发性胆囊癌组织中的表达呈正相关(r=0.791,P<0.01)。mTOR及p70S6K蛋白的阳性表达率与胆囊癌组织的分化程度、Nevin分期和淋巴结转移密切相关(均P<0.05),而与肿瘤直径、患者性别无明显关系。结论mTOR/p70S6K信号通路的特异性激活可能在原发性胆囊癌的发生、浸润、转移中起重要作用。

miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制研究

目的探讨miR-10b通过mTOR/P70S6K信号通路对宫颈癌大鼠的作用机制。方法采用人宫颈癌HeLa细胞株构建宫颈癌大鼠模型,分为Gg组(宫颈癌大鼠)、Gm组(注射miR-10b-mimics)、Gi组(注射miR-10b-inhibitions)。采用HE染色观察癌组织变化,Western blotting、RT-PCR检测mTOR/P70S6K的mRNA和蛋白表达水平,Transwell检测HeLa细胞的侵袭能力。结果Gg组肿瘤组织出现丰富的血供,界限分明,切面呈鱼肉状,肿瘤细胞大小较为均等;Gm组肿瘤组织中有大量纤维血管形成,肿瘤细胞大小不等,胞浆着色较深;Gi组肿瘤组织中纤维血管较少,胞浆着色稍浅。Western blotting结果显示,mTOR/P70S6K蛋白表达水平为Gm组<Gg组<Gi组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,mTOR/P70S6K mRNA水平为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05),miR-10b mRNA水平为Gi组<Gg组<Gm组(P<0.05)。Transwell结果显示,肿瘤细胞侵袭能力为Gi组>Gg组>Gm组(P<0.05)。结论miR-10b过表达可激活mTOR蛋白,增加P70S6K活性,抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

沉默YAP1可能通过调控mTOR/p70s6k信号通路对卵巢癌细胞生长和转移的影响

目的探讨Yes相关蛋白1(YAP1)可能通过调控mTOR/p70s6k信号通路对卵巢癌细胞生长和转移的影响。方法以卵巢癌细胞SKOV3为研究对象,将细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-YAP1组(转染si-YAP1)和si-YAP1+3-BDO组(转染si-YAP1后,加入100μmol/L的mTOR通路激活剂3-BDO)。然后采用qRT-PCR检测YAP1 mRNA的表达量;CCK8检测细胞活力;Western blot检测YAP1、Ki67、E-cadherin、N-cadherin和mTOR/p70s6k通路相关蛋白的表达;Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果si-YAP1组的YAP1 mRNA和蛋白表达、细胞活力、Ki67蛋白表达、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、N-cadherin蛋白表达、p-mTOR蛋白表达、p-p70s6k蛋白表达明显低于si-NC组,E-cadherin蛋白表达明显高于si-NC组。si-YAP1+3-BDO组的p-mTOR蛋白表达、p-p70s6k蛋白表达、细胞活力、Ki67蛋白表达、迁移细胞数目、侵袭细胞数目、N-cadherin蛋白表达明显高于si-YAP1组,E-cadherin蛋白表达明显低于si-YAP1组。结论沉默YAP1可能通过激活mTOR/p70s6k信号通路促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

下调Ets2表达对裸鼠食管鳞癌移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响

目的:探讨下调Ets2表达对裸鼠Eca109移植瘤生长及mTOR/p70S6K信号通路的影响。方法:选择已筛选出的在体外靶向下调Ets2基因表达的siRNA片段,构建包含此片段的慢病毒(LV-siE ts2)并感染Eca109,15只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和LV-siE ts2组,分别背部皮下接种Eca109、LV感染的Eca109和LV-siE ts2感染的Eca109,形成移植瘤,之后观察肿瘤生长情况、绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率。应用qRT-PCR检测肿瘤组织中Ets2 mRNA的表达,TUNEL法检测肿瘤组织细胞的凋亡,Western blot法检测肿瘤组织中Ets2、Caspase-3、Bcl-2、E-cadherin以及mTOR/p70S6K信号通路蛋白的表达。结果:LV-siE ts2组肿瘤生长速度明显变慢,肿瘤体积和质量显著小于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);LV-siE ts2组肿瘤组织中Ets2 mRNA及蛋白表达水平均显著降低;LV-siE ts2能引起Eca109细胞的凋亡,且上调Caspase-3和E-cadherin蛋白表达水平,而下调Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05);LV-siE ts2能显著降低mTOR及p70S6K的蛋白表达。结论:LV-siE ts2在体内通过抑制mTOR/p70S6K信号通路促进细胞凋亡,从而抑制裸鼠Eca109移植瘤的生长。

淀粉样β蛋白片段25~35下调大鼠海马PI3K/Akt/p70S6K信号传导通路(英文)

目的探讨阿尔茨海默病(AD)的淀粉样β蛋白(Aβ)的沉积是否损害神经细胞存活的信号传导通路。方法实验分为生理盐水对照组;Aβ25-35组;Aβ25-35+布洛芬组;Aβ25-35+布洛芬+LY294002组;Aβ25-35+LY294002组。大鼠分别灌胃给予布洛芬7.5或15 mg.kg-1,每日1次,连续3周后,左侧脑室内注射Aβ25-35(10 μL, 1 mmol.L-1),之后继续灌胃给予布洛芬1周。PI3K特异性阻断剂LY294002 (5 μL, 4 mmol.L-1)在注射Aβ25 -35前1 h左侧脑室内注射。注射Aβ25-35后1周,取海马CA1区,Western免疫印迹法观察P53,Bax, FasL, Bcl-2, Akt和p70S6K的蛋白表达水平。应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3活性测定试剂盒分析caspase 3活性变化,RT-PCR方法观察p70s6k mRNA表达水平。结果脑室内注射Aβ25-35可引起大鼠海马CA1区磷酸化Akt/PKB和磷酸化p70S6K表达明显降低,分别从对照组1.32±0.14和0.769±0.028下降到0.69±0.08和0.479±0.032。同时,海马CA1区促凋亡蛋白P53, Bax和FasL表达及caspase 3活性明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。预先注射LY294002可使caspase 3活性较单独注射Aβ25-35组进一步增加。给Aβ25-35前后连续给予布洛芬4周可明显对抗Aβ25-35引起的上述变化。LY294002可明显减弱布洛芬上调磷酸化Akt/PKB和磷酸化p70S6K表达的作用。结论 Aβ25-35引起抗凋亡通路PI3K/Akt/p70S6K下调可能参与AD的神经元损伤。布洛芬具有较好的对抗作用,这可能与上调PI3K/Akt/p70S6K通路中的一些蛋白有关。

mTOR/P70S6K信号通路活化在肝硬化门静脉高压症中意义的实验研究

目的探讨mTOR/P70S6K信号通路在早期肝硬化门静脉高压症中的活化状态,证实mTOR信号通路的激活参与肝硬化门静脉高压症的发病,并探讨其可能机制。方法本实验采用胆道结扎离断制备大鼠肝硬化门静脉高压症模型。雄性SD大鼠20只随机分为假手术组和模型组。通过组织病理学、形态学和血流动力学评估肝纤维化、炎症、和门静脉压力。采用RT-PCR和Western blot法分别测定肝纤维化标志物PC-αI、α-SMA、TGFβ1及PDGF基因的转录和mTOR信号通路标志物P70S6K和磷酸化的P70S6K(P-P70S6K)的表达。结果模型组大鼠胆道结扎离断3周后,P-P70S6K表达量明显增高而总蛋白P70S6K无显著差异,同时HSCs和胆管细胞活化增殖显著,肝脏促纤维化基因明显上调,间质胶原合成增加。结论mTOR/P70S6K信号通路主要以磷酸化功能状态参与肝硬化门静脉高压症的形成,阻断该通路可能成为肝硬化门静脉高压症治疗的新靶向。

电针通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区血管再生的研究

目的:观察电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K表达及CD34^+微血管密度变化的影响,探讨电针促进大脑缺血皮质区血管再生的机制。方法:140只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组、模型组、模型+电针组(电针组)、模型+电针+哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)组(抑制剂组);采用线栓法制备SD大鼠右侧局灶脑缺血/再灌注模型,缺血2h后将假手术组、模型组、电针组和抑制剂组各分为再灌注12h、24h、48h、72h、7d五个亚组;取大鼠"百会"穴(GV 20)及左侧"四关"穴(合谷LI 4/太冲LR 3)为电针刺激穴位,刺激时间30min/次,每日1次,最长持续7d;采用Western Blot检测各组大脑缺血皮质区磷酸化的蛋白激酶B(p-protein kinase B,p-AKT)、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、磷酸化的核糖体蛋白S6乳激酶(p-ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)蛋白的表达水平;免疫组化法检测大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34^+微血管血管的表达;Longa法检测神经功能。结果:与假手术组相比,模型组p-AKT蛋白的表达在24h、48h和72h增加(P<0.05),模型组p-mTOR和p-P70S6K的蛋白表达在48h、72h和7d增加(P<0.05),与模型组相比较,电针组各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达均显著增加(P<0.01),在RAPA的作用下,抑制剂组中各个时间点p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K蛋白的表达明显低于电针组(P<0.05);与模型组相比,电针组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34^+微血管的表达明显增多(P<0.01),与电针组相比,抑制剂组再灌注72h和7d大脑缺血皮质区VEGFR2蛋白、CD34^+血管减少(P<0.05);与模型组和抑制剂组相比,电针组再灌注72h、7d神经功能评分明显改善(P<0.05)。结论:电针可提高大鼠局灶脑缺血/再灌注大脑缺血皮质区p-AKT、p-mTOR和p-P70S6K的表达,可能通过AKT/mTOR/P70S6K通路促进大鼠大脑缺血皮质区血管的再生和神经功能的恢复。

PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路在人舌鳞癌细胞耐药中的作用

目的:通过抑制舌鳞癌细胞中PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路的表达,检测细胞凋亡与自噬的变化,探讨舌鳞癌耐药的机制。方法:以舌鳞癌细胞Cal27与舌鳞癌耐顺铂细胞Cal27/CDDP为研究对象。分别用PI3K/AKT抑制剂LY294002、mTOR抑制剂Rapamycin、p70S6K抑制剂LY2584702作用该通路各个环节。Western blot检测通路抑制剂作用后相关蛋白的变化。Cyto-ID荧光染色检测自噬体的形成。流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果:Western blot结果显示加入抑制剂后舌鳞癌细胞Beclin1表达分别高于对照组,LC3II与LC3I以及Bax与Bcl-2的比值均升高,该通路的p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K等蛋白均有下降(P<0.05)。流式结果显示加入抑制剂后的舌鳞癌细胞凋亡率分别较对照组升高(P<0.05)。Cyto-ID荧光染色后结果显示加入抑制剂后的舌鳞癌细胞自噬小体的数目明显高于对照组(P<0.05)。对比两组细胞显示加入抑制剂后的Cal27细胞发生凋亡与自噬的水平高于Cal27/CDDP(P<0.05)。结论:抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路可诱导舌鳞癌细胞Cal27与舌鳞癌耐顺铂细胞Cal27/CDDP发生凋亡与自噬,激活的PI3K/AKT/mTOR/p70S6K通路抑制细胞凋亡与自噬是Cal27/CDDP细胞产生顺铂耐药的原因之一。

复方肠泰方通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路诱导CT26细胞自噬的研究

目的:研究复方肠泰方对结肠癌CT26细胞增殖和自噬的影响及其可能的作用机制。方法:采用MTT法检测不同浓度复方肠泰方对CT26细胞增殖的影响,MDC染色法和透射电镜观察复方肠泰方干预CT26细胞后是否形成自噬体。蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的蛋白表达。采用自噬诱导剂雷帕霉素研究复方肠泰方是否诱导CT26细胞自噬性死亡。采用蛋白质印迹法检测Akt/mTOR/p70S6K通路相关蛋白表达水平。结果:复方肠泰方可以抑制CT26细胞的增殖;透射电镜观察到复方肠泰方干预的细胞中有类似自噬溶酶体结构;MDC结果显示,与空白对照组相比,复方肠泰方组细胞荧光强度增强;复方肠泰方能增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1的表达水平(P<0.05);与复方肠泰方组相比,复方肠泰方和雷帕霉素共同处理使CT26细胞的病死率显著增加(P<0.05);此外,复方肠泰方干预后,CT26细胞Akt、mTOR和p70S6K的蛋白表达基本不变,p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K的蛋白表达较空白对照组显著降低(P<0.05)。结论:复方肠泰方可能通过抑制Akt/mTOR/p70S6K通路诱导结肠癌CT26细胞自噬,从而发挥抗肿瘤作用。

S100A6通过PI3K/Akt信号通路促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移

目的：研究PI3K/Akt信号通路在S100A6介导的人骨肉瘤细胞143B的增殖和迁移中的作用.方法：首先制备重组的人S100A6蛋白（recombinant human S100A6,rhS100A6）;rhS100A6与PI3K抑制剂（LY294002和wortmannin）单独或同时处理143B细胞,其中rhS100A6的终浓度为30 mg/L,LY294002和wortmannin的终浓度分别为10 μmol/L和0.5 μmol/L;采用Western blotting分析143B细胞中PI3K/Akt信号通路相关分子总Akt（total Akt,t-Akt）及磷酸化Akt（phosphorylation of Akt,p-Akt）蛋白的表达变化,MTT检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移.结果：（1）成功制备rhS100A6蛋白,rhS100A6显著增强143B细胞的增殖和迁移能力（P〈0.05）;（2）rhS100A6上调143B细胞中Akt的磷酸化;（3）与rhS100A6组相比,rhS100A6与LY294002或wortmannin联合处理组143B细胞的p-Akt减少（P〈0.05）,细胞的增殖和迁移能力降低,在不同时点细胞的增殖率下降10.3%～69.7%,细胞迁移率下降37.9%～41.6%,差异均有统计学意义（P〈0.05）.结论：S100A6促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移的作用至少部分是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的.