Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后鸭组织中ALB基因表达的分析

检测Ⅰ型雏鸭肝炎病毒侵染后ALB基因mRNA以及ALB蛋白分别在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小脑、腿肌和胸腺等组织中的相对表达量和含量并分析其意义。分别利用实时荧光定量RT-PCR技术和ELISA法检测ALB基因在易感组、抗病组和对照组各组织中mRNA的表达量以及ALB蛋白含量。总体而言,除腿肌外,ALB基因mRNA在易感组中的表达量极显著低于对照组和抗病组(P<0.01),抗病组显著或极显著低于对照组(P<0.01或P<0.05);各处理组间,肝、小脑和胸腺中ALB蛋白含量与ALB基因mRNA相对表达量规律一致,在其他组织中,各处理组间ALB蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。RT-PCR与ELISA的结果比较可见,两者在肝脏、胸腺、小脑等与雏鸭肝炎病直接相关的指示性组织中表现一致。本试验研究结果,进一步揭示了ALB基因为Ⅰ型雏鸭肝炎病的抗性基因,与前期抑制性消减杂交法得到的结果一致,其表达量的变化可以作为区分易感鸭和抗病鸭的标志。

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达载体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型。方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达。MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究。

ALB、TLR7、PSPH和WSB1基因在雏鸭肝炎病毒易感与抗性群体间的差异表达分析

采用实时荧光定量RT-PCR技术检测雏鸭肝炎病毒侵染后对照组、易感组与抗性组ALB、TLR7、PSPH和WSB1mRNA分别在肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、腿肌和胸腺等组织中的相对表达量并分析其意义。结果表明,除腿肌外,ALB和TLR7基因在易感组中的表达量极显著低于对照组和抗性组(P<0.01),抗性组的表达量显著或极显著低于对照组的表达量(P<0.01或P<0.05);PSPH和WSB1基因在易感组中的表达量极显著高于对照组(P<0.01),而抗性组与对照组差异不显著(P>0.05)。研究结果揭示了鸭ALB和TLR7基因为雏鸭肝炎病毒的抗性基因,其表达量的变化可以作为区分易感鸭和抗病鸭的标志。

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株。方法PCR扩增获得ALB启动子，并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc—ALB质粒，脂质体转染质粒到不同细胞，ALB—GLuc活性检测功能。构建逆转录病毒，感染HP14．5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株，经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB—GLuc检测荧光素酶活性，免疫荧光检测ALB的表达。结果PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游，HEK293、HP14．5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB—GLuc活性与免疫荧光结果一致。HP14．5ALB—Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活，免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强，并与ALB—Gluc活性升高一致。结论成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株，为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段。