AlkB同源蛋白5去除前mRNA加工因子6的mRNA甲基化修饰调控肝细胞癌的细胞增殖

目的探讨AlkB同源蛋白5(AlkBhomolog5,ALKBH5)在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的细胞增殖中的作用。方法通过癌症基因组图谱数据库分析ALKBH5和前mRNA加工因子6(pre-mRNA processing factor 6,PRPF6)在HCC组织中的表达水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的mRNA和蛋白表达水平。荧光原位杂交确定ALKBH5和PRPF6在HCC细胞系(Huh7和Hep3B)中的亚细胞定位。在免疫沉淀复合物中检测PRPF6的N6-甲基腺苷甲基化水平。通过过表达和敲低基因表达的方法,将Huh7细胞和Hep3B细胞分别进行转染,分组为sh-NC组(阴性对照转染细胞)、sh-ALKBH5实验组(ALKBH5干扰序列转染细胞)、sh-ALKBH5+ex-PRPF6实验组(ALKBH5干扰序列转染+PRPF6 pcDNA 3.1过表达质粒转染细胞),并采用CCK-8和染色增殖试验检测各组细胞的增殖情况。裸鼠异种移植瘤实验验证ALKBH5和PRPF6在体内的生物学功能。蛋白质印迹法检测各组细胞中AKT/mTOR通路相关蛋白的表达水平。结果HCC细胞中ALKBH5的表达上调,可以去除PRPF6的甲基化修饰。体外和体内实验结果显示,ALKBH5可通过调节PRPF6的表达参与HCC细胞的恶性增殖。此外,敲低ALKBH5会抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化,而PRPF6的过表达则有助于AKT和mTOR的磷酸化。结论ALKBH5能促进HCC细胞的增殖,相关机制是通过ALKBH5/PRPF6/AKT/mTOR轴实现的。

基于ALKBH5调控GSK3β/mTOR通路抑制过度自噬探讨速效救心丸减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制

目的:基于HL-1细胞自噬水平及相关通路关键蛋白表达探讨速效救心丸经Alk B同源蛋白5(ALKBH5)信号转导调控糖原合成酶激酶3β(GSK3β)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路抑制过度自噬而发挥对心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤保护作用的机制。方法:构建慢病毒干扰载体,筛选最佳干扰慢病毒。将HL-1细胞随机分为3组,并进行空白转染、ALKBH5转染、GSK3转染,各组再随机分为4组分别进行缺氧/复氧(模型组)、缺氧/复氧+速效(速效组)、缺氧/复氧+川芎嗪(川芎嗪组)、缺氧/复氧+冰片(冰片组)处理。通过自噬双标腺病毒(m RFP-e GFP-LC3)双荧光染色检测自噬流,细胞计数法(CCK8)检测细胞增殖,双染色双变量流式细胞分析法(Annexin V/PI)检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测GSK3β、m TOR含量及自噬相关基因(Atg)5、苄氯素1(Beclin1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、自噬标志物p62蛋白表达。结果:ALKBH5过表达可抑制GSK3β表达,增强m TOR表达(P<0.05)。CCK8法检测m RFP-e GFP-LC3的双荧光染色检测自噬流结果显示,与空白转染比较,ALKBH5转染可促进自噬,GSK3β转染可抑制自噬(P<0.05)。CCK8法检测细胞增殖结果显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可促进细胞增殖;与空白转染比较,ALKBH5组可抑制细胞增殖,GSK3β可促进细胞增殖(P<0.05)。Annexin V/PI双染色法检测心肌细胞凋亡显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组均可抑制细胞凋亡;与空白组比较,ALKBH5转染及GSK3β转染均可增加细胞凋亡(P<0.05)。Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达显示,与模型组比较,速效组、川芎嗪组、冰片组可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。与空白转染比较,ALKBH5转染可增强LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,抑制m TOR表达;GSK3β转染可抑制LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Atg5、Atg7、p62表达,增强m TOR表达(P<0.05)。结论:速效救心丸及其有效成分冰片、川芎嗪经ALKBH5/GSK3β/m TOR信号通路抑制过度自噬,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。

复发性流产患者胎盘绒毛中FTO mRNA和ALKBH5 mRNA水平表达及临床价值研究

目的 探讨胎盘绒毛组织中肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein,FTO)mRNA和AlkB同源蛋白5(Alk B homologous 5,ALKBH5)mRNA水平与复发性流产的相关性。方法 选取2019年12月~2021年1月深圳市中西医结合医院产科接收的98例复发性流产患者为复发性流产组,同期选取正常早孕人工流产者96例作为对照组。比较两组一般资料;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测两组受试者胎盘绒毛组织FTO mRNA和ALKBH5mRNA水平;采用Pearson法分析复发性流产患者胎盘绒毛组织FTO mRNA与ALKBH5 mRNA水平相关性;采用单因素及多因素Logistic回归分析影响复发性流产的因素。结果 复发性流产组胎盘绒毛组织FTO mRNA(0.72±0.16),ALKBH5 mRNA(0.64±0.18)水平低于对照组(1.02±0.24,1.01±0.21),差异均有统计学意义(t=10.263,13.185,均P <0.05)。复发性流产患者胎盘绒毛组织FTO mRNA与ALKBH5 mRNA水平呈正相关(r=0.537,P <0.05)。流产次数> 3次的复发性流产患者胎盘绒毛组织FTO mRNA(0.40±0.12),ALKBH5 mRNA(0.47±0.11)水平低于流产次数3次患者(0.86±0.18,0.72±0.14),差异具有统计学意义(t=12.615,8.561,均P <0.05)。单因素Logistic回归分析结果显示,孕囊大小为复发性流产发生的危险因素[OR(95%CI):2.025(1.468~2.794),P <0.05],FTO mRNA,ALKBH5 mRNA为复发性流产发生的保护因素[OR(95%CI):0.730(0.548~0.972);0.655(0.492~0.873),均P <0.05]。多因素Logistic回归分析结果显示,FTO mRNA和ALKBH5 mRNA为复发性流产发生的独立保护因素[OR(95%CI):0.674(0.519~0.874),0.541(0.392~0.747),均P <0.05]。结论 复发性流产患者胎盘绒毛组织FTO mRNA和ALKBH5 mRNA低表达,二者为复发性流产发生的独立保护因素。

去甲基化酶ALKBH5在肺腺癌组织中的表达及其与细胞增殖的关系

目的:探讨N6-甲基腺苷化修饰(N6-methyladenosine,m6A)去甲基化酶Alk B同源蛋白5(Alk B homologue 5,ALKBH5)在肺腺癌组织中的表达及其临床意义,并探讨靶向抑制ALKBH5的表达对肺腺癌细胞增殖的影响。方法:应用免疫组织化学法检测88例肺腺癌组织及其对应的癌旁组织中ALKBH5的表达,分析ALKBH5表达与肺腺癌患者临床特征间的关系及其在预后判断中的价值。将ALKBH5-siRNA转染至肺腺癌H1650、H1975和HCC827细胞后,应用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,蛋白质印迹法检测Ki-67和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果:ALKBH5在肺腺癌组织中的高表达率(44.3%,39/88)高于相应的癌旁组织(20.5%,18/88,P=0.001),并且ALKBH5的表达与肺腺癌患者的临床分期有关(P<0.01);ALKBH5高表达的肺腺癌患者预后较差(P=0.009),ALKBH5表达水平是肺腺癌患者预后的独立影响因子(P=0.038)。ALKBH5-siRNA转染后,肺腺癌H1650、H1975和HCC827细胞的克隆形成能力均显著减弱(P值均<0.05),Ki-67和PCNA蛋白的表达水平均显著降低(P值均<0.01)。结论:ALKBH5的表达与肺腺癌的恶性进展密切相关,沉默ALKBH5的表达具有抑制肺腺癌细胞克隆形成的作用。因此,ALKBH5是治疗肺腺癌的潜在靶点。

N^(6)-甲基腺嘌呤去甲基化酶FTO和ALKBH5在肿瘤中的研究进展

N^(6)-甲基腺嘌呤(N^(6)-methyladenosine,m^(6)A)作为真核生物m RNA最常见的转录后修饰形式,对m RNA的可变剪接、5’和3’端加工、出核以及翻译等行为有着广泛的影响,并参与了多种机体的生理活动。随着m^(6)A去甲基化酶脂肪和肥胖相关基因蛋白(fat mass and obesity-associated protein,F TO)以及Alk B同源蛋白5(AlkBhomologue5,ALKBH5)的发现,m^(6)A修饰调节被认为是动态可逆的。肿瘤中异常表达的F TO和ALKBH5蛋白往往导致m^(6)A修饰水平紊乱,这对肿瘤干细胞维持以及肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭乃至对放化疗的敏感性都有着重大影响。在大多数肿瘤中,异常表达的FTO和ALKBH5蛋白发挥着促癌效应,这使得对m^(6)A去甲基化酶抑制剂的探索成为了近年来的研究热点。然而,由于FTO和ALKBH5同属于Alk B双加氧酶家族,都有着保守的共同结构,这造成高特异性抑制剂的开发困难重重。本文将综述m^(6)A去甲基化酶在各种肿瘤中的作用机制以及生物学效应,同时还将概述当前m^(6)A去甲基化酶抑制剂的研究进展,以期全面了解m^(6)A去甲基化酶作为肿瘤诊断和预后生物标志物或是关键治疗靶点的可能性。

逍遥丸对小鼠卵母细胞分泌因子生长分化因子-9受体及Smads通路的影响

目的:观察逍遥丸对小鼠卵母细胞分泌因子生长分化因子-9(GDF-9)受体BMPRⅡ、ALK-5及下游Smads通路中Smad2、Smad3的影响。方法:将120只小鼠随机分为4组:疏肝高、低剂量组;COH组和空白对照组,每组30只。应用免疫组化和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法分别测定卵母细胞中BMPRⅡ、ALK-5、Smad2、Smad3蛋白及mRNA的表达。结果:与空白对照组比较,COH组及疏肝低剂量组BMPRⅡ蛋白及mRNA表达无统计学意义;疏肝高剂量组BMPRⅡ蛋白及mRNA表达增强(P<0.05)。ALK-5、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表达在各组间比较均无统计学意义。结论:高剂量逍遥丸可上调卵母细胞中GDF-9Ⅱ型受体BMPRⅡ蛋白及mRNA表达,但并未影响ALK-5、Smad2、Smad3的表达,提示逍遥丸影响卵子质量的机制与GDF-9一型受体及下游Smads通路无关。