蛋白酶体抑制剂ALLN对HERG-A561V蛋白转运异常的影响

目的研究蛋白酶体抑制剂ALLN对hERG-A561V突变蛋白转运异常的影响,并观察分子伴侣Calnexin(CNX)/Calreticulin(CRT)在此过程中的作用。方法瞬时转染pcDNA3-WT-hERG、pc DNA3-A561V-hERG、pc DNA3-WT/A561V-hERG、pc DNA3-L539fs/47-hERG、pcDNA3-WT/L539fs/47-hERG致HEK-293T细胞分别构建野生、突变和杂合型细胞模型;蛋白酶体抑制剂ALLN以10 mol/L的浓度孵育各组细胞模型24 h;运用免疫荧光检测ALLN干预前后h ERG蛋白在细胞内的分布情况,免疫共沉淀检测ALLN干预前后hERG蛋白与Calnexin/Calreticulin的结合情况。结果通过免疫荧光实验发现ALLN干预h ERG-A561V突变及杂合细胞模型后,胞浆及细胞膜均可见h ERG表达较干预前增加,而干预野生型h ERG和hERG-L539fs/47细胞24 h后,h ERG蛋白分布无明显变化。通过免疫共沉淀实验,发现相较野生型h ERG,分子伴侣Calnexin/Calreticulin与h ERG-A561V结合明显增多;ALLN干预各组模型24 h后Calnexin/Calreticulin表达增多,且h ERG-A561V突变及杂合组细胞模型h ERG蛋白与Calnexin/Calreticulin结合,相较野生hERG及h ERG-L539fs/47组明显增多。结论ALLN纠正了h ERG-A561V突变蛋白的转运障碍,临床有潜在治疗因基因突变致蛋白转运异常所致长QT综合征的可能性,且内质网分子伴侣Calnexin/Calreticulin可能在其中发挥重要作用。

Calpain抑制剂ALLN对H2O2诱导的661W细胞损害的影响

目的探讨ALLN(N-acetyl-leu-leu-norleucinal)在过氧化氢(H_2O_2)对661W光感受器细胞的毒性损害过程中的可能影响。方法 MTT法测定H_2O_2对661W细胞活性的影响;Western blot法检测在H_2O_2作用661W光感受器细胞中不同时间点Calpain 1和Calpain 2的蛋白水平。结果 MTT结果表明,H_2O_2作用于661W细胞24 h后,661W细胞数明显下降;100μmol·L^(-1)的H_2O_2作用于661W细胞12、18、24 h,Calpain 1和Calpain 2的蛋白水平随H_2O_2作用时间的延长而增加;MTT法测定661W细胞活性,发现ALLN+H_2O_2组细胞活性明显比单纯H_2O_2组高;MTT法检测不同浓度ALLN组(25、50、100、200μmol·L^(-1))的细胞活性,结果显示ALLN组细胞活力与空白对照组无明显差别。结论Calpain抑制剂ALLN可减轻H_2O_2对661W细胞的毒性损害作用,为光感受器细胞氧化损伤及保护提供了实验依据。

不同浓度钙蛋白酶抑制剂ALLN对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察不同浓度的钙蛋白酶抑制剂ALLN对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响。方法Ca^2＋和ALLN干预C2C12细胞后，采用噻唑蓝法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况，采用Giemsa染色观察细胞形态。结果0．5、1、2、4、8、16、32、64、128mmol／L Ca^2＋干预C2C12细胞72h的吸光度（A）值显著低于对照组（均P〈0．05）；16mmol／L的Ca^2＋和AUN干预6、12、24、36h后，AUN1—7组（含16mmol／LCa^2＋和AIJN终浓度为3．125、6．25、12．5、25、50、100、200 μmol／L的无血清培养基）A值均显著高于Ca^2＋组（干预6h：0．449±0．024、0．472±0．022、0．513±0．008、0．540±0．014、0．588±0．016、0．607±0．030、0．700±0．020比0．355±0．012，P值均为0．000；干预12h：0．407±0．007、0．414±0．006、0．434±0．004、0．441±0．003、0．460±0．010、0．484±0．006、0．525±0．006比0．368±0．027，P值均为0．000；干预24h：0．436±0．005、0．431±0．015、0．441±0．006、0．459±0．013、0．527±0．009、0．581±0．005、0．599±0．011比0．386±0．007，P值均为0．000；干预36h：0．464±0．022、0．460±0．018、0．461±0．007、0．434±0．020、0．454±0．028、0．479±0．006、0．524±0．011比0．379±0．011，P值均为0．000），干预48～72h后差异无统计学意义。36h时ALLN10、50、100、200μmol／L组的凋亡率分别为（6．00±1．20）％、（5．02±1．13）％、（4．89±1．11）％、（2．71±1．15）％，均显著低于Ca^2＋组（13．70±2．30）％（P值均为0．000）。Giemsa染色显示Ca^2＋组出现细胞凋亡形态学改变，ALLN组细胞凋亡情况明显改善。结论16mmol／L的Ca^2＋可诱导C2C12细胞凋亡，ALLN可抑制细胞凋亡、促进增殖，该作用呈时间和剂量依赖性。

钙蛋白酶抑制剂ALLN对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察钙蛋白酶抑制剂ALLN对骨肉瘤细胞株U2OS、MG63增殖和凋亡的影响.方法 培养骨肉瘤细胞株U2OS和MG63,采用浓度分别为0.1、1.0、10.0、100.0、1 000.0μmol/L的ALLN处理,噻唑蓝（MTT）法检测ALLN对于骨肉瘤细胞株U2OS和MG63体外生长的抑制作用,流式细胞术和Western blot检测ALLN的凋亡诱导作用,克隆形成实验检测ALLN对骨肉瘤细胞株U2OS和MG63克隆形成能力的影响.结果 ALLN对于骨肉瘤细胞株U2OS和MG63有明显的生长抑制作用,U2OS和MG63的半数抑制浓度均约为10 μmol/L,ALLN作用于骨肉瘤细胞株U2OS和MG63后可明显诱导其细胞凋亡,同时ALLN也可降低两种细胞的克隆形成能力.结论 ALLN可明显抑制骨肉瘤细胞株的增殖,促进细胞凋亡.

阿米洛利抑制载脂蛋白A1诱导小鼠巨噬细胞ABCA1的降解

目的探讨钠氢交换体1抑制剂阿米洛利对载脂蛋白A1(Apo A1)诱导小鼠三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)降解的影响。方法给小鼠静脉注射Apo A1后不同时间点收集腹腔巨噬细胞,定量实时聚合酶链反应及Western blot检测巨噬细胞ABCA1 mRNA及蛋白水平变化。进而,Apo A1干预8 h小鼠给予腹腔注射阿米洛利或钙蛋白酶抑制剂ALLN,实验分为4组:对照组、阿米洛利组、ALLN组及阿米洛利+ALLN组,Western blot检测巨噬细胞ABCA1蛋白水平,荧光法检测钙蛋白酶活性。结果 Apo A1干预小鼠后ABCA1 mRNA无明显改变,而ABCA1蛋白水平迅速升高,8 h达高峰后逐渐降低。阿米洛利组、ALLN组及阿米洛利+ALLN组ABCA1蛋白水平均比对照组高;在0、4、8 h时间点,阿米洛利组、ALLN组及阿米洛利+ALLN组间ABCA1蛋白水平差异无统计学意义;而在12、16 h时间点,阿米洛利+ALLN组ABCA1蛋白水平较阿米洛利组、ALLN组升高。与对照组比较,阿米洛利组、ALLN组及阿米洛利+ALLN组钙蛋白酶活性均降低;阿米洛利组、ALLN组、阿米洛利+ALLN组3组组间比较,钙蛋白酶活性各时间点均无明显差异。结论阿米洛利在活体内抑制Apo A1诱导ABCA1蛋白降解及钙蛋白酶活性,提示钠氢交换体1可能至少部分通过改变钙蛋白酶活性参与ABCA1的降解。

Calpain 1在水杨酸钠诱导耳鸣大鼠的下丘脑神经元中的表达及对听力的影响

为了考察Calpain 1在水杨酸钠诱导耳鸣大鼠的下丘脑神经元中的表达及对听力的影响,本研究通过腹腔注射水杨酸钠建立耳鸣大鼠模型,并腹腔注射钙蛋白酶抑制剂ALLN来处理大鼠。听性脑干反应(ABR)测试显示,水杨酸钠可显著升高大鼠的的听力阈值和Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ波潜伏期、Ⅰ~Ⅴ和Ⅲ~Ⅴ波间潜伏期,而钙蛋白酶抑制剂可明显抑制这种变化。免疫组化、RT-PCR和Western blotting检测结果均显示,水杨酸钠可明显上调大鼠下丘组织中Calpain 1的表达,而钙蛋白酶抑制剂可显著抑制Calpain 1的上调。此外,钙蛋白酶抑制剂可显著抑制水杨酸钠诱导的大鼠下丘组织中NMDA受体亚型NR2A的上调。水杨酸钠上调了大鼠耳蜗核组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,而钙蛋白酶抑制剂可显著抑制炎症因子的表达。本研究提示,水杨酸钠可损伤大鼠的听觉功能,上调Calpain 1、NMDA受体和促炎细胞因子的表达。钙蛋白酶抑制剂可显著改善大鼠的听觉功能,其机制与抑制Calpain 1、NMDA受体和促炎细胞因子的表达有关。