简化ALS活性测定方法的可行性探讨

为探讨在离体法测试ALS活性实验中简化提取ALS蛋白步骤和廉价易购的二硫苏糖醇(DTT)替代黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)可行性,以暗培养的玉米幼苗为ALS提取材料,测定了粗蛋白、半精蛋白、精蛋白提取方法提取的ALS蛋白对ALS活性的酶促反应效果;分析了DTT替代FAD辅酶的可行性。试验结果,ALS蛋白提取过程中,可用缓冲液代替液氮碾磨材料,离心速度可降至为10,000 r/min;酶促反应效果粗蛋白酶好于半精蛋白酶、半精蛋白好于精蛋白酶。在离体法测定ALS活性体系中,DTT替代黄素腺嘌呤二核苷酸FAD配制的缓冲液对ALS蛋白的提取及酶促反应效果类似于FAD缓冲液,但由于提取ALS蛋白中携带痕量FAD分子,所以尚未证明在酶促反应中DTT分子完全替代FAD分子起到了ALS辅酶作用。