截短ALT1蛋白的获得及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化截短ALT1蛋白,制备ALT1多克隆抗体。方法利用pCold TF载体原核表达系统,IPTG诱导,表达经生物信息学分析含有两个编码ALT1抗原表位的ALT1 N端1～115个氨基酸序列的基因片段,依次经镍(Ni)离子亲和柱纯化、HRV 3C蛋白酶酶切、二次镍离子亲和柱纯化和分子筛柱层析得到不带标签的截短ALT1纯蛋白,用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果经测序证实,成功构建了截短pCold TF-ALT1表达载体。获得纯度达90%的不带标签的截短ALT1重组蛋白,制备了效价达4.0×106的ALT1多克隆抗体,经Western blot鉴定,能特异性地识别ALT1抗原和肝细胞裂解液。结论成功获得高质量的截短ALT1无标签蛋白及其特异的多克隆抗体,为ALT1的免疫学检测试剂的研发提供了依据。

评价ALT1快速检测试剂对肝病患者的诊断价值

目的通过与速率法检测结果进行比较,评价肝病人群中丙氨酸转氨酶1(alanine aminotransferase 1, ALT1)快速检测试剂检测血清ALT酶活性的真实性、可靠性和预测值。方法采用诊断试验的横断面研究设计,选取江苏省人民医院感染病科2019年10月—2020年1月就诊的肝病患者作为研究对象,调查研究对象一般情况并采集全血标本进行测试。通过诊断试验评价方法,计算肉眼判读与仪器检测下试剂检测血清ALT酶活性的诊断试验指标。结果本研究共纳入患者233人。其中男性占60.94%(142/233),女性占39.06%(91/233);门诊患者占50.64%(118/233),住院患者占49.36%(115/233);研究对象中位年龄为51(四分位间距:40~60)岁。肉眼判读试剂的灵敏度为99.28%(137/138),特异度为22.11%(21/95),准确度为67.81%(158/233),约登指数为0.213 9,阳性预测值为64.93%(137/211),阴性预测值为95.45%(21/22)。仪器检测下试剂的灵敏度为99.28%(137/138),特异度为45.26%(43/95),准确度为77.25%(180/233),约登指数为0.445 4,阳性预测值为72.49%(137/189),阴性预测值为97.73%(43/44)。肉眼判读下试剂重测的Kappa值为0.654 7,仪器检测下试剂重测的Kappa值为0.557 0。结论 ALT1快速检测试剂的特异度和阳性预测值较低,真实性有待进一步验证,但可靠性较好,或将用于肝病患者居家自行检测。

血清丙氨酸转氨酶轻度升高的慢性乙型肝炎临床流行病学横断面调查分析

目的:研究血清丙氨酸转氨酶(ALT)轻度升高(ALT 1～2×ULN)的慢性乙型肝炎(CHB)临床流行病学特点。方法:用多中心、大样本、横断面临床流行病学调查方法,采集此类患者的一般资料及实验室、影像学检查结果,用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。结果:ALT轻度升高CHB患者男女比例为2.5∶1,主要集中在21～40岁年龄段,HBeAg阳性与HBeAg阴性患者分别占65.1%和34.9%。肝功能除ALT平均水平轻度升高外,其他指标的平均水平均无明显异常。血清HBV DNA水平复制较高。彩色多普勒超声检查显示有超过2/3的患者肝脏回声增粗;超过1/3的患者肝内血管欠清晰。尽管血清ALT轻度升高,但绝大部分的患者都存在中度以上的肝脏炎症及不同程度的肝纤维化。结论:ALT轻度升高的CHB患者需要密切随访及监测其肝功能及HBV DNA水平,或建议其行肝穿刺以及早进行抗病毒治疗,以延缓病情的进展及并发症的过早发生。

人丙氨酸氨基转移酶同工酶在人体组织中的分布

文中拟通过采用基因重组技术获得ALT1和ALT2同工酶重组蛋白,分别制备筛选出高特异性、高活性的ALT1和ALT2单克隆抗体(ALT1单克隆抗体已成功制备并发表),初步探讨ALT1和ALT2同工酶在人体组织中的定位、分布及表达情况。采用RT-PCR方法从人肝癌细胞(HepG2)中扩增ALT2基因,将成熟的ALT2基因亚克隆至pET32a-ALT2原核表达载体中,并将其连接产物转化至BL21(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导表达ALT2蛋白,镍柱(Ni+)亲和层析法纯化ALT2重组蛋白。ALT2重组蛋白免疫Balb/c小鼠,选取阳性血清小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,间接ELISA法挑选阳性细胞株,有限稀释法进行亚克隆,采用亲和层析柱法纯化ALT2抗体。通过RT-PCR和Western blotting方法检测ALT1和ALT2在人体正常组织中的表达和分布,研究结果显示组织中的ALT同工酶基因在mRNA水平和蛋白水平上的表达几乎一致。ALT1在肝脏、肾脏、骨骼肌高表达,胃肠道平滑肌中等表达;ALT2在脂肪、骨骼肌、心肌中高表达,胃肠道平滑肌低表达。免疫组化研究表明,ALT1在肝细胞、肾髓质小管和肌纤维中高表达,ALT2在脂肪细胞、心肌细胞中高表达,胃肠道组织ALT1和ALT2主要表达于肠壁上部区域黏膜,上述结果显示同工酶ALT1和ALT2在组织中分布广泛,为理解不同病理条件下ALT活性升高的变化机制提供理论依据。