ALV-J感染对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫因子的影响

为探究J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫反应的影响,试验利用密度梯度离心法和贴壁法,从鸡脾脏组织中分离得到单核细胞,并通过显微镜观察培养至24 h、72 h、120 h单核细胞的分化过程;通过PCR扩增ALV-J特异性引物H5/H7,验证脾脏巨噬细胞对ALV-J的易感情况;同时,通过qPCR验证感染ALV-J后鸡原代脾脏巨噬细胞中炎性因子、干扰素及肿瘤抑制因子的表达。结果显示:单核细胞分化至第120 h形成形态正常的巨噬细胞,通过流式细胞技术检测鸡巨噬细胞表面特异性标记蛋白发现,84.9%的细胞为KUL01阳性细胞;鸡原代脾脏巨噬细胞对ALV-J易感,并且ALV-J可整合进鸡原代脾脏巨噬细胞基因组中;对感染ALV-J的鸡脾脏巨噬细胞进行形态观察,发现ALV-J感染导致鸡脾脏巨噬细胞形态逐渐萎缩直至死亡;ALV-J感染6 h、12 h、24 h及48 h可诱导鸡原代脾脏巨噬细胞炎性因子(IL-1β、IL-6)的表达显著上调,在ALV-J感染24 h、48 h诱导肿瘤抑制因子(TNF-α)的表达显著上调(P<0.05);并且在早期(感染3 h)诱导干扰素(IFN-β)及干扰素刺激基因(CH25H、STAT1、PKR)表达,后期(感染48 h)抑制部分干扰素刺激基因(OAS、STAT1、ZAP、Mx、PKR)的表达。研究表明ALV-J感染鸡原代脾脏巨噬细胞早期可诱发强烈的天然免疫反应,后期可能通过抑制IFN-β及部分干扰素刺激基因的表达实现免疫逃逸。

快、慢羽鸡抗ALV-J天然免疫差异的研究

研究旨在探索快、慢羽鸡对禽白血病感染的天然免疫反应差异。试验采用J亚群禽白血病病毒(ALV-J)SCAU-HN06株接种快羽鸡和慢羽鸡,从接种病毒后第1天开始,每隔1天采样至第15天,采用实时荧光定量和ELISA检测快、慢羽鸡干扰素α(IFN-α)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及抗病毒基因的表达情况。结果显示:慢羽鸡较快羽鸡极显著易感ALV-J(P<0.01);接种病毒后env基因的相对表达量在快羽鸡体内上升较慢羽鸡缓慢,表达峰值较慢羽鸡小;慢羽鸡接种病毒第1天IFN-α、TNF-α和IL-12蛋白表达量高于快羽鸡,随后IFN-α、TNF-α、IL-10和IL-12的蛋白表达量呈降低趋势,第11天表达量降低不显著(P>0.05);快羽鸡在接种病毒后第1天IFN-α、TNF-α和IL-12蛋白表达量升高,第13天极显著降低(P<0.01);快羽鸡抗病毒基因OAS、PKR、MX表达量显著或极显著高于慢羽组且强度强(P<0.05或P<0.01)。综上所述,慢羽鸡免疫系统比快羽鸡更早被ALV-J突破,慢羽鸡抗ALV-J的天然免疫反应比快羽鸡迟钝且强度较弱。

病毒REV与ALV-J经鸡胚垂直传播共感染对雏鸡的协同致病性

【目的】J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和禽网状内皮组织增殖病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)均可通过鸡胚垂直传播,且两者在鸡胚中的自然共感染已有报道,但两者经鸡胚共感染的致病性未有研究。建立ALV-J与REV垂直传播共感染的实验动物模型,研究ALV-J与REV垂直传播共感染的致病作用及其对禽白血病净化检测的影响,以期为推动多病原协同净化提供参考。【方法】通过鸡胚接种方式构建分别携带ALV-J、REV及两者共感染的雏鸡感染模型,通过孵化率、死亡率、体重、胎粪ALV-p27抗原检出率、病毒血症阳性率等指标分析REV与ALV-J在垂直传播中共感染的致病性。【结果】ALV-J+REV共感染组鸡胚孵化率为65.71%,低于单感染组和空白组(CK);共感染组死亡率高于单感染组和CK。7日龄时CK、ALV-J组、REV组、ALV-J+REV组雏鸡平均体重分别为59.25、50.83、49.67、43.78 g,共感染加重了对雏鸡生长的抑制。ALV血浆病毒分离结果显示,ALV-J组、ALV-J+REV组阳性率在各日龄均为100%,CK均为0%。采集肛拭子检测ALV-p27抗原结果显示,ALV-J+REV组雏鸡阳性率在1、3、7、14日龄分别为91.30%、94.12%、90.90%和100%,肛拭子的ALV-J p27阳性检出率低于血浆病毒分离。比较免疫器官发育指数结果显示,ALV-J和REV单感染均导致雏鸡免疫器官萎缩,共感染加重免疫器官萎缩程度。免疫器官病毒载量显示,REV与ALV-J共感染促进了ALV-J在免疫器官中的增殖,同时ALV-J也促进了REV在免疫器官中的增殖。【结论】相对于ALV-J和REV单感染,两者共感染降低了鸡胚孵化率、增加了雏鸡死亡率、增强了对雏鸡生长的抑制作用,对诱导胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官萎缩的影响更加显著,且两者在共感染过程中对彼此复制均有促进作用。

1株诱发血管瘤的ALV-J的分离鉴定及其囊膜基因的进化分析

【目的】了解湖北某黑羽蛋鸡场J亚群禽白血病(J-avian leukosis)的来源及其囊膜基因进化趋势,为湖北地区禽白血病流行病学调查提供资料。【方法】运用病理学、ELISA和Multi-PCR方法对疑似血管瘤型J亚群禽白血病病毒(J-Avian leucosis virus,ALV-J)病例进行实验室诊断,制备病毒液接种DF-1细胞进行病毒分离及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测,并通过DNAStar等软件分析该毒株囊膜蛋白编码基因。【结果】病例呈现典型血管瘤病变,p27抗原检测呈阳性,Multi-PCR出现ALV-J特异性条带,IFA结果显示特异性荧光,表明分离到1株ALV-J,命名为HB2021017。分离株HB2021017囊膜蛋白ENV、膜表面糖蛋白SU、跨膜蛋白TM与所引用的ALV-J毒株中的髓细胞瘤型毒株、髓细胞瘤和血管瘤混合型毒株、血管瘤型的ALV-J毒株的氨基酸序列相似性逐步升高。系统进化树分析显示,分离株HB2021017的env基因与中国地方品种鸡群中分离的诱发血管瘤的ALV-J毒株亲缘关系最近,处于同一分支;而与其他鸡群分离诱发血管瘤或髓细胞瘤的ALV-J毒株亲缘关系较远,处于不同的分支。【结论】本研究确诊并分离到1株诱发血管瘤的ALV-J(HB2021017),本土地方品种鸡群中分离的诱导血管瘤的ALV-J毒株囊膜基因已经形成了相对独立的进化分支。

三重PCR和双重荧光探针法检测ALV-A/J亚群方法的建立与应用

为快速检测禽白血病病毒(avian leukemia virus,ALV)并同时鉴别A亚群(ALV-A)和J亚群(ALV-J),根据ALV不同亚群基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立通用型、A亚群与J亚群三重PCR以及A亚群与J亚群双重荧光探针检测方法。结果显示:三重PCR检测方法能特异性扩增ALV所有亚群以及A亚群和J亚群,检测灵敏度达1×103拷贝/μL;建立的ALV-A/J双重荧光探针检测方法特异性强,可检测的最低拷贝浓度为40拷贝/μL。本研究建立的三重PCR方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒均有较高的符合率(Kappa系数>0.75);针对24份发病鸡精液,ALV-A/J双重荧光探针检测方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒检测结果一致;本研究建立的两种检测方法均能同时鉴别出ALV A亚群和J亚群。利用本研究建立方法对安徽省394份临床样本进行检测,发现ALV总阳性率为38.58%,以J亚群单一感染为主,同时伴有A亚群单一感染以及A/J亚群混合感染。结果表明,本研究建立的ALV-通用型/A亚群/J亚群三重PCR方法和ALV-A/J亚群双重荧光探针检测方法特异性强,检测快速,具有临床样本检测的应用潜力,为临床上快速诊断及有效防控ALV感染及鉴别A/J亚群的单一或混合感染提供了技术支持。

旧院黑鸡TYR基因第四内含子中ALV的插入频率和类型研究

有研究表明TYR基因第四内含子中ALV的插入缺失与禽类的羽毛颜色有关,本研究旨在探讨旧院黑鸡TYR基因第四内含子中ALV的插入频率和类型,为进一步探讨其与旧院黑鸡羽毛颜色的相关性提供参考。采用双重PCR对ALV插入整合进行检测、测序,DNA测序序列通过相关分子生物学软件比对与分析,从而分析序列中的识别位点和突变位点。用引物Diag05-dw进行测序,可以看出在不含ALV插入整合频率的N片段中,只存在一个6 bp的识别位点5′-CAGTGT-3′;将不含ALV插入整合频率的N片段的测序结果与参考序列DQ118702.1进行比对,共发现有5个SNP,这5个SNP都位于第四内含子,重要的识别位点5′-CAGTGT-3′存在一个SNP位点5890 G/A。

鸡抗ALV-J感染的先天免疫应答途径研究进展

J亚群禽白血病病毒(Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)是禽外源性逆转录病毒,主要诱发肿瘤性疾病和免疫抑制,ALV-J在所有禽白血病病毒亚群中具有最强的致病性和传染性,给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。由于宿主对病毒难以产生有效的免疫应答,加之病毒的基因组变异频率较快,至今为止,既没有有效的疫苗可以预防,也没有有效的药物可以治疗。只能通过病原检测、淘汰阳性鸡、净化种群来防控。本文对宿主抵抗ALV-J感染的先天免疫应答途径进行了概括总结,阐述ALV-J的免疫抑制机制、宿主的先天免疫系统和抗病毒感染的相关信号通路,并对ALV-J未来的相关研究方向作了展望,以期为该病的研究和防控提供理论参考。

不同地方品种鸡ALV感染情况调查及其净化

目的了解不同地方品种鸡中ALV的自然感染状态。方法采集扬州某种鸡场3个地方品种鸡(芦花鸡、苏禽绿壳鸡、新杨黑鸡)、2个时期(15周龄、25周龄)的泄殖腔棉拭子3600份和血清样品600份,分别采用p27抗原检测试纸条和ELISA检测试剂盒进行检测,同时,采集部分p27抗原检测阳性鸡的抗凝血,提取基因组,利用J亚群特异性引物进行PCR检测。结果15周龄时p27抗原检测试纸条与ELISA检测总阳性率分别为30.67%和31.38%;25周龄时总阳性率分别为11.20%和12.50%。ALV-J亚群PCR检测结果显示,阳性样品可扩增出特异性符合目的545 bp条带。结论我国地方品种鸡存在ALV的感染,且主要以ALV-J亚群为主。

用ALV-Jgp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法,对病理学初步诊断为蛋用型鸡 J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经,用特异性抗 J亚群禽白血病病毒(ALV J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测,待检的组织切片中均检出阳性抗原,免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡 J亚群禽白血病的自然病例。

基于Dempster-Shafer证据推理理论的ALV视觉信息融合

本文针对Ｄｅｍｐｓｔｅｒ－Ｓｈａｆｅｒ（Ｄ－Ｓ）证据推理理论所存在的问题进行了新的推广，同时考虑证据的相关性与冲突性而修正了Ｄｅｍｐｓｔｅｒ组合规则，并将推广后的Ｄ－Ｓ理论应用于ＡＬＶ实际非结构化道路网环境中视觉信息的融合，研究并探索了信息融合实际应用中诸多具有较大难度的问题，取得了有意义的结果．

应用组织芯片免疫组化法检测ALV-J

禽白血病J亚群(ALV-J)是英国的Payne和他的同事们在20世纪90年代初从肉鸡中分离出来的新亚群,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病。自1999年,我国一些肉用型种鸡场陆续发生了禽白血病J亚群。并且近几年来,ALV-J已从最初只引起肉种鸡发病开始向蛋鸡及中国地方种鸡蔓延。组织芯片技术是一种新型特殊的生物芯片技术,它能明显提高工作效率,减少实验误差。本研究将组织芯片技术和免疫组化染色结合起来,用特异性抗ALV-J囊膜蛋白gp85的单克隆抗体来检测发病鸡只的各组织器官的组织切片。在肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、腺胃、骨髓、髓细胞瘤组织均检出病毒阳性抗原。结果表明组织芯片技术和免疫组化染色相结合为临床诊断ALV-J提供了一个高通量、敏感的检测方法。

REV与ALV-J共感染对肉鸡T淋巴细胞免疫功能与组织病理学的影响

【目的】研究致瘤性病毒REV、ALV-J单一感染和共感染肉鸡后血液和脾T淋巴细胞的免疫功能与脾组织病理学的变化。【方法】用一定剂量的REV和ALV-J单一感染及共感染1日龄肉鸡,取感染后不同日龄鸡的血液和脾组织,无菌分离淋巴细胞,用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测T淋巴细胞增殖活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性,并对脾脏进行组织切片、H.E染色检测组织病理学变化,通过免疫荧光抗体结合试验(immunofluorescence assay,IFA)分析组织病毒感染量变化。【结果】感染REV和ALV-J的肉鸡血液和脾T淋巴细胞的增值活性和CTL杀伤活性在整个感染监测期出现降低,单一感染比,共感染两种病毒的肉鸡在某些阶段出现T淋巴细胞免疫功能抑制加重;检测感染后17d和37d的脾脏组织病理学变化表明感染病毒的脾脏组织出现间质稀疏,淋巴细胞数量减少,生发层被破坏或减少,17d较37d出现病理变化更为明显;同时采用荧光标记的单克隆抗体进行IFA检测发现脾内淋巴细胞含有大量病毒粒子,在共感染两种病毒的肉鸡脾细胞内均检测出两种病毒,且含有病毒数量明显多于单一感染一种病毒的肉鸡。【结论】REV和ALV-J共感染后肉鸡T淋巴细胞功能抑制更为严重,这可能与两种病毒在肉鸡体内数量积聚增加、互为促进有重要关系;同时这两种病毒感染后造成T免疫细胞增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤活性降低,可能是病毒持续感染、增殖及组织病变、产生肿瘤细胞的前提,本研究为家禽临床生产中防治REV和ALV-J感染提供免疫学基础。

河北省蛋鸡群ALV p27抗原ELISA检测

禽白血病（Avian Leukusis,AL）是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓、萎缩以及肿瘤等,造成鸡的生产性能下降甚至死亡,由鸡分离的ALV划分为A、B、C、D、E、J六个亚群。自2002年蛋鸡群发现禽白血病以来,全国各地频发,特别是自2009年以来,湖北、山东等地鸡白血病疑似病例频发,鸡群ALV的感染率高达60%,病死率高达50%以上[1]。

ALV-A诱发蛋鸡髓细胞瘤和淋巴瘤混合型禽白血病自然病例初报

湖北某蛋鸡场发生肿瘤性疾病,剖检可见病鸡肝、肾、脾肿大,肝脏表面有大小不等的灰白色结节,其中2只(2/7)病鸡肠系膜明显增厚并布满大量灰白色结节。取病变组织制备石蜡切片,HE染色,部分病鸡(4/7)可见髓细胞瘤及淋巴细胞瘤。采集病变组织进一步进行PCR、病毒分离和IFA等实验室检测,结果病料组织DNA中仅检测出A亚群禽白血病病毒(ALV-A)核酸序列,未检测出其他亚群ALV;用病料制备组织悬液接种的DF-1细胞,IFA呈ALV-A阳性、ALV-J阴性。将分离的病毒静脉接种无外源性ALV感染的13日胚龄蛋鸡鸡胚,可复制出与自然病例类似的肿瘤。结果表明,分离的病毒为ALV-A,病鸡确诊为由ALV-A引起的髓细胞瘤和淋巴细胞瘤混合型禽白血病。这是在国内首次发现ALV-A诱发蛋鸡髓细胞瘤和淋巴瘤混合型禽白血病的自然病例。

无磁钢20Mn23AlV保护渣液渣和渣圈性能变化对连铸的影响

对高铝无磁钢20Mn23AIV(/%:0.14～0.20C、21.50～25.00Mn、1.50～2.50Al、0.04～0.10V)200 mm板坯连铸过程结晶器保护渣液渣和渣圈的化学组成、理化性能和结晶矿相进行了对比分析。保护渣原渣组成为(/%):31.91CaO、30.30SiO_2、6.58Al_2O_3、1.12MgO、3.02MnO、7.73Na20、7.10F。结果表明,连铸开浇后15 min,液渣和渣圈中的SiO_2含量分别降低至22%和18%,Al_2O_3含量分别提高至20.5%和25.5%,其碱度由原渣的1.05分别提高至1.7和2.0。此时液渣及渣圈的熔化温度和粘度大幅度增加,转折温度大幅度降低;渣圈的化学成分及理化性能的变化幅度均大于液渣。连铸开浇15 min后液渣及渣圈的成分与性能均趋于稳定。高熔点相钙铝黄长石的析出是促使渣圈形成的重要原因。

ALV 路径跟踪模糊控制及参数 GA 寻优

本文分析和设计了一种适合于ＡＬＶ（ＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＬａｎｄＶｅｈｉｃｌｅ地面自主车）路径跟踪的模糊控制器，并采用遗传算法（ＧｅｎｅｔｉｃＡｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，简称ＧＡ）优化模糊规则及隶属函数的大量参数，从仿真研究的结果来看，提出的方法是有效的。

ALV-A p27基因的原核表达及其鼠源多克隆抗体的制备

试验拟通过构建A亚群禽白血病病毒(ALV-A) p27基因原核表达载体,从而制备抗p27蛋白鼠源多克隆抗体。将感染ALV-A毒株的DF-1细胞反复冻融后提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR扩增获得ALV-A p27基因,将目的基因克隆至pColdⅠ载体,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌中进行诱导表达,经镍柱纯化后免疫28～32日龄的雌性小鼠,采用间接ELISA法测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。试验经PCR扩增出750 bp左右的特异性条带,并成功构建pColdⅠ-ALV-A-p27原核表达载体,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG于18℃诱导表达18～24 h成功得到重组蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测显示,制备的鼠源多克隆抗体血清抗体效价为1∶3 200;Western blot检测结果表明,制备的多克隆抗体能特异性识别原核表达的p27蛋白。试验结果在ALV的抗原分析、血清学诊断等方面有着重要的应用价值。

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)的攻毒试验

将禽白血病病毒 J亚群 (AL V- J)内蒙株 NM876 1和 NM9996人工接种于 1日龄爱维茵肉种鸡 ,通过眼观、病理组织学检查观察了攻毒鸡的病理学特征 ;通过 PCR和 EL ISA技术检测了病毒感染率、抗体变化规律以及病毒和抗体的相关性。结果显示 ,攻毒鸡从第 3周开始即可检出病毒 ,NM876 1株和 NM9996株病毒感染率分别为 71.4 %和6 4 .3% ;从第 5周开始 ,出现较明显的病理学变化 ,病变特征以骨髓、肝脏、心脏、脾、卵巢等组织内髓细胞增生为主 ,而法氏囊、脑、坐骨神经无变化 ;攻毒鸡抗体消长变化有一定的规律 ,一般在 7～ 8周龄和 18～ 2 0周龄时分别出现 1次高峰 ,而在 4～ 6周龄、10周龄和 2 3周龄分别出现 1次低谷 ,提示鸡场进行 EL ISA检测时要避开这一时期 ;攻毒鸡产生耐受性病毒血症 ,即病毒阳性而抗体阴性 (V+A- )的比例较高 (7/14 ,9/14 )。通过以上的研究证明 ,AL V- J内蒙株疾病模型复制成功 ,NM876 1。

黄芪多糖和甲砜霉素影响ALV-J对SPF鸡致病性的分析

为验证育雏早期应用黄芪多糖及甲砜霉素对ALV-J先天性感染雏鸡发病作用的影响,通过5日龄SPF鸡胚卵黄囊接种1 000TCID50ALV-J,鸡胚出壳后随机分为3组,两试验组分别定期口服黄芪多糖和甲砜霉素,一组作为病毒感染对照。对试验雏鸡泄殖腔排毒规律、病毒血症、疫苗免疫水平、免疫器官指数、体重、肿瘤发生率、肿瘤类型等进行动态测定,评估黄芪多糖和甲砜霉素对雏鸡先天感染ALV-J发病作用的影响。结果表明,两种药物对ALV-J病毒血症、ALV-J抗体及疫苗免疫抗体的产生无显著影响。黄芪多糖组与病毒感染对照组体重差异不显著;甲砜霉素组早期体重明显高于其他两组,但后期体重却明显低于另外两组。甲砜霉素组育雏早期血液中白细胞和淋巴细胞的水平显著低于另外两组,60日龄后脾和法氏囊的免疫器官指数显著降低,与另外两组差异显著。肿瘤发生率以甲砜霉素组最高,达28.57%(10/35),其次是病毒感染对照组,为20%(7/35),黄芪多糖组最低,仅为11.43%(4/35)。另外,甲砜霉素组肿瘤类型多,出现血管瘤、髓样细胞瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤和腺癌,并且肿瘤进展快,病变重。育雏早期应用甲砜霉素会导致雏鸡免疫抑制,促进ALV-J的致瘤作用,患病鸡肿瘤呈多样化特征。黄芪多糖对ALV-J的致病性有一定的抑制作用,但未发现对病毒血症的影响。两种药物对ALV-J的致病作用的影响机制有待于进一步研究探讨。

自动化码头ALV实时任务分配

为弥补自动化集装箱码头自动装载车（Automated Lifting Vehicle,ALV）先到先服务（First Come First Service,FCFS）分配方式的缺陷,提出基于触发事件的ALV作业任务实时分配方式.设置一组触发事件触发ALV实时分配,以ALV到达任务作业点估计时间最短为目标,建立ALV实时分配模型,选用A^＊算法对该模型进行求解.通过与贪婪算法的对比,验证A^＊算法的优越性.对用A^＊算法求解大型集装箱码头ALV实时分配问题的求解速度和稳定性进行实验测试,结果验证了选用A^＊算法的可行性.