J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立

利用抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9,建立了检测ALV-Jenv抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。应用该方法检测SPF鸡血清、鸡抗禽流感H9亚型阳性血清、鸡沙门氏菌阳性血清、鸡腺病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清,结果均为阴性,无交叉反应;抗ALV-J阳性血清与ALV-J特异性单克隆抗体JE9能相互阻断;ALV-J阳性血清经酸处理后,ELISA检测的D490差值明显下降。对部分攻毒鸡血清样本及田间ALV-J阳性血清样本进行电镜观察,可见ALV-J样病毒粒子及ALV-J样免疫复合物。经与间接免疫荧光(IFA)检测ALV-Jenv抗体结果比较表明,建立的ELISA方法与IFA方法两者具有较好的群体符合率,群体符合率为8/9。这些结果表明,本研究建立的ELISA方法在ALV-J的诊断中具有很好的应用前景。

河北省蛋鸡群ALV p27抗原ELISA检测

禽白血病（Avian Leukusis,AL）是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称,可引起感染鸡免疫抑制和多组织器官发育迟缓、萎缩以及肿瘤等,造成鸡的生产性能下降甚至死亡,由鸡分离的ALV划分为A、B、C、D、E、J六个亚群。自2002年蛋鸡群发现禽白血病以来,全国各地频发,特别是自2009年以来,湖北、山东等地鸡白血病疑似病例频发,鸡群ALV的感染率高达60%,病死率高达50%以上[1]。

晋北散养边鸡群ALV-p27携带率及ALV-A/B与ALV-J亚群的ELISA检测

为了解晋北地区农户散养边鸡群ALV感染情况,从鸡群中采集蛋清和血清样品共92份,应用ELISA方法检测ALV-p27抗原及蛋清和血清样品中ALV-A/B与ALV-J抗体阳性率。ELISA结果显示,92份蛋清和血清样品的ALV-p27抗原检出率为9.78%,ALV-A/B与ALV-J抗体阳性率分别为20.00%和6.25%。检测结果表明,晋北散养蛋鸡群同时感染外源性ALV-A/B与ALV-J亚群,且主要以A/B亚群为主,不存在ALV-A/B与ALV-J 2种或3种亚群的共感染。

3种ELISA试剂盒检测不同亚型外源性鸡白血病病毒的比较

为建立一种稳定、快速从感染鸡体内检测或分离外源性鸡白血病病毒(ALV)的简易方法,作者使用A亚型(ALV-A)、C亚型(ALV-C)以及2株J亚型(ALV-J-PY和ALV-J-WS)鸡白血病病毒(ALV)按高、中、低(即100、10、1μL)3种接种量人工接种DF1细胞,在接种后不同时间用A、B、C 3种ELISA试剂盒检测ALV抗原(P27)。结果表明,对ALV-A和ALV-J-PY,高剂量接种时,用A试剂盒在接种后第3天即可检测出;低剂量接种时,第7天可检出。使用B试剂盒,2株病毒的检出时间延长(高剂量组分别为第7天和第5天;低剂量组分别为第15天和第13天);使用C试剂盒,所需检出时间最长(接种后第13天)。对ALV-C和ALV-J-WS毒株,A试剂盒对高剂量组,分别能够在接种后第5天和第9天检出,其它中、低接种量组15 d内均没有检出;而B、C2个试剂盒对3个接种剂量组均没有检测出。从以上结果看出,3种ELISA试剂盒对3种亚型ALV毒株的检出时间存在明显不同,A试剂盒灵敏度最高,能最早作出检测;B试剂盒灵敏度次之。同时,无论使用哪种试剂盒ALVs的检出时间与病毒接种量间存在很大的相关性。本研究结果为外源性ALV的检测及病毒分离研究提供一定的科学依据。

不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒-p27抗原结果的影响

为探讨不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒(ALV)-p27抗原结果的影响,试验首先对180日龄地方品种母鸡的泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原进行ELISA检测,选取部分阳性鸡和阴性鸡进行分组试验,采用ELISA对试验鸡血清、蛋清和病毒分离的细胞培养液进行ALV-p27抗原检测,采用RT-PCR方法检测血液ALV特异性基因。结果显示,阳性组中以血清、蛋清和细胞培养液作为ELISA ALV-p27抗原检测材料,其检测阳性率均低于泄殖腔棉拭子,血清检测的阳性个体包含全部蛋清和细胞培养液ELISA检测的阳性个体。ELISA检测数据的相关性分析显示,只有血清和细胞培养液检测数据间存在显著性相关,线性关系方程为Y(细胞上清)=1.8439X(血清)-0.1469,R2=0.937;阳性组中ALV-p27基因检测阳性率低于泄殖腔棉拭子,但高于血清、蛋清和细胞培养液,其包含所有血清ELISA检测的阳性样品;外源性ALV-J gp85基因阳性率仅为29.17%,且阳性样品均属于血清ELISA阳性样品。综上所述,成年鸡以泄殖腔棉拭子作为ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果,蛋清和细胞培养液作为检测材料存在漏检的可能,血清作为ELISA检测材能够更准确地反映成年鸡群ALV感染状态。

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。

4种ELISA试剂盒检测禽白血病病毒效率比较

对采集鸡蛋清、泄殖腔肛拭子以及蛋清或泄殖腔肛拭子检测阳性的鸡只之血清接种DF-1细胞的上清液,分别采用A、B、C、D 4种ELISA试剂盒进行ALV-P27抗原的3次试验检测。结果显示,A试剂盒的蛋清和病毒分离的敏感度最高,B试剂盒对肛拭敏感性最高。A试剂盒的3次试验检测的符合率都在87%以上,并且较稳定,结果可信度高;C试剂盒的符合率在79%以上,相对稳定;B和D试剂盒的符合率都不稳定。

种鸡场鸡白血病的净化研究(Ⅰ)——ALV感染情况调查

应用双抗夹心酶联免疫吸附试验 (DAS- EL ISA )对北京地区和河北部分种鸡场及 1家 SPF鸡场进行了鸡白血病病毒感染情况的调查 ,结果发现 :不同品系的鸡对 AL V的感染率有显著差异 ;分别采用蛋清与肛拭作为试验样品 ,得到的结果是不相同的 ,研究认为 。

前列腺小体外泌蛋白ELISA检测方法的建立和初步评价

目的建立前列腺小体外泌蛋白ELISA检测方法并评价其作为慢性前列腺炎辅助诊断的可行性。方法从慢性前列腺炎患者尿液中提取并纯化前列腺小体外泌蛋白,以纯化的前列腺小体外泌蛋白为抗原免疫实验BALB/c小鼠,得到单克隆抗体经过纯化后,建立ELISA检测方法。并对笔者所在医院的140例慢性前列腺炎患者尿液及正常人60例尿液中的前列腺小体外泌蛋白含量进行检测和评价。通过正交试验确定特异性抗体和酶标抗体的最佳工作浓度,并对试剂盒进行了4℃,12个月保存实验。确定该检测方法的临界值。结果慢性前列腺炎症患者尿液中前列腺小体外泌蛋白含量明显高于正常人尿液中含量,有显著性差异(Z=10.74,P<0.05)。实验室临界值为1.24 ng/ml。在140份慢性前列腺炎患者尿样中,阳性率为88.5%;特异性为90%。将前列腺小体外泌蛋白试剂盒测定结果与临床金标准比较[Kappa=0.75(95%CI=0.652 to 0.848),P<0.01],该检测试剂盒与临床金标准有高度一致性。试剂盒各个成分在低温保存12个月可以保持稳定。结论前列腺小体外泌蛋白的检测试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性合格,可以为临床前列腺炎诊断提供可靠的依据。

尿液中前列腺小体外泄蛋白检测两种ELISA方法的比较

目的:比较两种尿液中前列腺小体外泄蛋白(PSEP)ELISA检测方法。方法:收集100例ⅢA型前列腺炎患者和100例正常人尿液标本,采用ELISA双抗夹心法和间接法进行检测;同时用稀释液基质(0.1 mol/L PBS缓冲液)标曲系统和尿液基质标曲系统测试30例临床尿液标本,验证标准品与待测标本在不同基质情况下的一致性。结果:ELISA双抗夹心法和间接法两种检测方法,其灵敏度分别为89%和87%,特异度分别是91%和90%,总符合率分别为90%和88.5%,两者无统计学差异。以稀释液基质标曲系统和尿液基质标曲系统测试的结果散点图显示,R^2=0.999,具有良好的线性,稀释液基质与临床尿液样本没有明显的基质差异,互换性良好。结论:根据PESP其自身特性,PSEP检测试剂盒ELISA间接法用于临床检测前列腺炎患者尿液标本切实可行。

不同检测技术在K亚群禽白血病病毒检测中的应用

禽白血病(avian leukosis,AL)以垂直传播为主,被列为我国种禽场必须要实现净化的主要禽病之一,通过1日龄雏鸡胎粪检测淘汰等程序是实施AL净化的主要步骤之一。K亚群禽白血病病毒(ALV-K)是近年来在黄羽肉鸡群中流行的主要亚群。为比较不同检测方法对ALV-K的灵敏度差异,将ALV-K经卵黄囊接种感染SPF鸡胚后构建垂直感染模型,对1日龄雏鸡采集胎粪和抗凝血,接种DF-1细胞后进行病毒分离,维持7 d收取细胞上清。收集胎粪以及胎粪和抗凝血的病毒分离细胞上清等样品构建样品盘,分别以磁微粒化学发光检测试剂盒、3家公司ELISA试剂盒、胶体金检测试纸条等进行检测。结果显示,确定样品盘利用不同检测方法的阳性检出率均为100%,各检测技术检出结果一致;但不同方法的灵敏度有差异,其中磁微粒化学发光技术灵敏度优势明显,可更好地判定ALV垂直传播状态。本研究提出了一种可评估不同检测技术灵敏度的良好模型,为进一步理解不同检测技术用于AL净化的价值提供了参考。

禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较

本试验以80只300日龄的A品系蛋鸡为试验对象,分5个日龄段按翅号采集蛋清、泄殖腔棉拭子,无菌抗凝血和血清。用ALV p27抗原检测试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子。将无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞,培养一周后用同样方法检测上清收集液,分析该群鸡只在不同日龄段泄殖腔棉拭子阳性、蛋清样本阳性和病毒分离阳性之间的相关性。用ALV-Ab抗体试剂盒检测各日龄段血清的抗体水平。此外,选取某一日龄段蛋清和泄殖腔拭子样本用4个不同厂家的ALV p27抗原检测试剂盒进行检测比较。结果表明,5个日龄段泄殖腔棉拭子平均阳性率为61%,蛋清样本平均阳性率为72.6%,病毒分离平均阳性率为48.8%。5个日龄段ALV的抗体阳性率一直为零;4个厂家的ELISA试剂盒对同一批样本的检测结果表明,IDEXX试剂盒的敏感度最高。本试验为外源性鸡白血病病毒检测及鸡白血病净化其方法的应用、试剂盒的选择、减少判定的误差、提高净化效果提供了一定的科学依据。

江西省主要养鸡地区4种鸡免疫抑制病的血清学调查

对江西省11个地市主要养鸡地区的24个鸡群的460份血清样品用ELISA方法进行了鸡传染性贫血(CIA)、禽网状内皮细胞增生症(RE)、禽呼肠孤病毒感染(ARV)血清抗体的检测,并对其中的368份血清样品用ELISA方法进行了J-亚型禽白血病(ALV-J)血清抗体的检测,结果CIAV、REV、ALV-J、ARV(ELISA)抗体总阳性率分别为80.65%、21.30%、6.52%、96.30%。结果表明目前江西省各地饲养的鸡群中这4种免疫抑制病的感染相当普遍,而且多为混合感染,感染一种及以上免疫抑制病的个体为99.13%,同时感染两种及以上免疫抑制病的个体为56.96%,同时感染3种及以上免疫抑制病的个体为20.43%,同时感染4种免疫抑制病的个体为2.17%。

核酸杂交技术在禽白血病病毒TCID_(50)测定中的应用

为探索核酸杂交技术在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)细胞半数感染量(TCID50)中的可行性,将ALV-J传染性克隆r NX0101株以10倍梯度稀释后按常规方法接种已长满单层鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,在维持7 d后收集细胞培养上清。上清液部分按照试剂盒说明书进行p27抗原的ELISA检测,另一部分提取RNA后以鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒进行Dot-blot检测,每孔中细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体进行IFA检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算三种方法测定的TCID50。结果显示ELISA法、IFA法和Dot-blot法在确定病毒感染中能够相互验证和补充,该病毒在CEF的TCID50分别为10-4.7TCID50/0.1 m L、10-5.2TCID50/0.1 m L和10-5.3TCID50/0.1 m L。表明采用Dot-blot法测定ALV-J的TCID50是可行的,不仅能够排除内源性的干扰,并且比ELISA和IFA具有更高的灵敏度。

J亚群白血病的病理学观察及PCR诊断

从某肉种鸡场取疑似J亚群白血病的自然发病鸡 ,剖检 ,观察病理学特征 (光镜、电镜 )。随后对该场进行ALV_J抗体ELISA检测 ,发现感染率达 2 8% ,从中选取部分抗体阳性鸡及阴性鸡剖检 ,取肝进行ALV_J特异性PCR检测。结果 :自然发病鸡病变明显 ,在肝、脾、肾、睾丸 (卵巢 )肺等多种组织肿大 ,并有大小不等的灰白色结节。镜检 :病灶内及肿瘤主要由密集的髓细胞组成 ,在大脑、小脑坐骨神经中未见。电镜 ,肿块中的髓细胞样瘤细胞呈圆形、核圆形或椭圆形 ,体积大小不一、染色质边集 ,胞浆中溶酶体增多 ,有些电子密度较高 ,有些趋于溶解 ,肝细胞体积增大 ,核浓缩或淡染 ,胞浆中线粒体增多 ,肿胀 ,嵴减少或消失 ,在胞浆膜下有病毒粒子存在。PCR结果 :6例抗体阳性鸡和部分自然病例PCR阳性而 2只对照鸡PCR阴性。通过以上证据可知 ,病变明显的和抗体阳性的鸡PCR结果全部为阳性 ,证明鸡体内病毒与抗体共存 ,而抗体阴性 ,病毒阳性的结果未出现 ,说明此肉种鸡场感染的ALV_J大部分是由于水平传播造成的。

J亚群禽白血病病毒TCID_(50)不同测定方法的比较

为比较不同方法在测定J亚群禽白血病病毒(ALV-J)组织细胞半数感染量(TCID50)上的差异,将ALV-J传染性克隆r NX0101株同一病毒保存液以10倍梯度稀释后按照常规方法分别接种已长满DF-1细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的96孔板,维持7 d后取所有细胞培养上清以ALV-p27抗原检测试剂盒检测p27抗原,细胞固定后以ALV-J特异性单克隆抗体JE9进行间接免疫荧光(IFA)检测,确定病毒感染孔后按照Reed-Muench法分别计算两种方法在两种细胞上的TCID50。结果显示,ELISA法测定该病毒在DF-1细胞和CEF细胞上的TCID50分别为10-5.4TCID50/0.1 m L和10-4.666TCID50/0.1 m L,而IFA法测定该病毒在DF-1和CEF细胞上的TCID50分别为10-6.333TCID50/0.1 m L和10-5.2TCID50/0.1 m L。结果表明,IFA比ELISA具有更高的灵敏度,并且ALV-J在DF-1细胞上复制能力比CEF更强,在DF-1细胞上测定ALV-J的TCID50更为科学。

禽白血病病毒抗原检测能力比对样品的制备

研究制备了禽白血病病毒抗原检测能力比对样品。禽白血病病毒(ALV)经56℃1h灭活后,采用商品化试剂盒进行初步定值,并用DMEM稀释制备出强、弱阳性和阴性样品,分装后保存。采用ELISA方法进行比对样品均匀性和稳定性检验,并发送32个实验室进行测试,所有参试实验室的检测结果符合定值范围。结果显示制备的比对样品均匀性和稳定性良好,满足检测能力验证要求。

抗禽白血病p27抗原单克隆抗体的制备与鉴定

检测p27抗原的检测试剂在禽白血病的研究和防治方面有着极其重要的作用。为研究国产的禽白血病诊断试剂,利用禽白血病各亚群病毒的p27蛋白很保守的特点,我们将原核表达的禽白血病p27蛋白作为抗原,免疫8周龄的BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得三株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过Western_blotting和ELISA的结果分析证明,三株单抗与原核表达得p27蛋白和禽白血病各亚群病毒反应,而不与禽流感病毒等反应。可以看出,这三株单抗在ALV的抗原分析、血清学诊断和疫苗质量监测以及禽白血病污染细胞检测等方面有着极其重要的应用价值。

广西规模鸡场鸡白血病感染情况调查

用IDEXX公司的禽白血病(ALV)3种ELISA试剂盒对广西规模鸡场不同类别鸡群的血清、喉头/泄殖腔棉拭子、蛋清样品进行禽白血病J亚群(ALV-J)抗体、A和B亚群(ALV-AB)抗体、p27抗原进行检测,发现规模场不同种类鸡群感染程度不同。血清中ALV-J阳性率11.33%(338/2 982),其中核心群鸡阳性率8.87%(86/970),生产群鸡阳性率为12.87%(138/1 072),种公鸡阳性率为12.13%(114/940);p27抗原检测蛋清阳性率为5.48%(43/785),喉头/泄殖腔棉拭子阳性率为15.25%(122/800),蛋清样品检出率低于喉头/泄殖腔棉拭子。另对2个场血清和蛋清ALV-AB、ALV-J、ALV(p27抗原)进行对应检测比较,发现三者没有线性关系,即ALV-J感染率高,ALV-AB和p27抗原检测率不一定高;ALV-AB抗体高,ALV-J和p27抗原阳性率也不一定高。

酶联免疫吸附法(ELISA)检测阿尔茨海默病尿液生物标志物的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)作为老年痴呆最主要的类型,其患者数量增长快速。鉴于AD病程的不可逆性,早期筛查和诊断对采取必要的干预措至关重要。尿液标本检测具有方便、无创、患者接受程度高、适于筛查的优势,近年来在生物标志物开发和应用领域受到了重点关注。本文拟对采用酶联免疫吸附法检测AD尿液生物标志物的最新进展进行概述,旨在为AD体液生物标志物的开发和临床应用研究提供新思路。