转AM79-EPSPS基因耐草甘膦大豆的获得及功能验证

以天隆一号大豆为受体材料,通过农杆菌介导的遗传转化方法,从消毒时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)添加浓度、草甘膦添加浓度和生根阶段吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,IBA)浸没时间等因素出发,探究并建立高效的转AM79-EPSPS基因大豆转化体系,将具有我国自主知识产权的新基因AM79-EPSPS导入大豆,并验证它在转基因大豆中的功能。结果表明:当种子消毒时间为6~8 h,AS添加浓度为200μmol/L,草甘膦添加浓度为100μmol/L,IBA浸没时间为30 s时,转化效果最好。通过该转化体系获得了6株转AM79-EPSPS基因耐草甘膦大豆苗,并对其T0、T1、T2代植株进行了蛋白检测及草甘膦喷施实验。结果表明:在各世代转基因植株中均能检测出AM79-EPSPS蛋白,说明AM79-EPSPS基因能够在大豆中正常表达;喷施草甘膦后,非转基因大豆植株全部枯萎,而转AM79-EPSPS基因大豆植株均能正常生长,表现出明显的草甘膦耐受性。

调控葡萄酒石酸生物合成基因VvbHLH79克隆及表达

【目的】酒石酸不仅影响葡萄果实的味道,还决定葡萄酒的色泽、口感、微生物稳定性和陈酿潜力。探讨调控酒石酸生物合成的转录因子及其机制,通过生物技术调控葡萄内源酒石酸的积累或定向培育高酒石酸积累型优良酿酒葡萄品种具有重要价值。【方法】研究以酿酒葡萄‘琼瑶浆’、‘马瑟兰’为试验材料,用PCR方法从中克隆到与酒石酸含量相关的VvbHLH79转录因子,对其进行生物信息学和亚细胞定位分析;用HPLC和qRT-PCR技术测定葡萄果实在不同发育时期的酒石酸含量和VvbHLH79的表达量;并构建植物表达载体,用农杆菌介导的果梗侵染法瞬时转化葡萄幼果果实之后检测VvbHLH79的表达量和酒石酸含量。【结果】(1)通过RNA-seq测序筛选获得1个葡萄VvbHLH79基因,该基因CDS序列全长831 bp,编码277个氨基酸,分子质量为66.22 kD,理论等电点为5.15,属于无信号肽和跨膜结构的不稳定亲水性蛋白;氨基酸序列第147-232位含有bHLH-SF保守结构域,属于bHLH转录因子家族;亚细胞定位在细胞核。(2)葡萄VvbHLH79编码蛋白与河岸葡萄中的bHLH89编码蛋白(登录号:XP_034699340.1)序列一致性最高,达到99.64%。(3)VvbHLH79相对表达量随着‘琼瑶浆’果实发育降低,从坐果期到成熟期降低了67.25%;酒石酸积累主要在葡萄果实转色之前,转色之后酒石酸含量就快速下降。(4)VvbHLH79在低酒石酸葡萄果实中瞬时过表达后使酒石酸含量显著升高,而将VvbHLH79在高酒石酸葡萄果实中沉默后酒石酸含量显著下降,证实VvbHLH79基因正向调控酒石酸含量。【结论】VvbHLH79转录因子可能在葡萄酒石酸生物合成通路中发挥作用。

基于RPA技术对转CP4-EPSPS基因产品的快速检测

核酸检测在农产品安全检测中的应用十分广泛,随着转基因作物的商业化种植,迫切需要一种快速、特异、灵敏的转基因作物检测方法。利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对含有转基因产品及其制品中CP4-EPSPS基因进行检测,共设计5对引物来筛取最佳引物,并对反应体系和反应温度进行优化。结果表明,该方法采用20μL体系在37℃恒温反应15 min即可对CP4-EPSPS基因进行快速检测。该方法检测转基因的灵敏度阈值为45拷贝,灵敏度高、特异性强,为大规模筛查CP4-EPSPS基因提供了一种新的途径。

两种花色绿绒蒿MiUGT79B1和MpUGT79B1基因的克隆及表达分析

为探究尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)在不同花色绿绒蒿中的序列特征及其与绿绒蒿花色的关系,以黄色花的全缘叶绿绒蒿和红色花的红花绿绒蒿为研究材料,从2种花色绿绒蒿的全长转录组数据中各筛选1个UGT基因,根据转录组KEGG注释结果,将这2个基因分别命名为MiUGT79B1和MpUGT79B1,并对其进行克隆、生物信息学及RT-qPCR分析。结果表明:MiUGT79B1和MpUGT79B1基因ORF长度为1314,编码437个氨基酸。MiUGT79B1和MpUGT79B1蛋白的结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,属于亲水性稳定蛋白。系统进化树和多序列比对分析发现,MiUGT79B1和MpUGT79B1与鸦片罂粟、火罂粟、野罂粟和博落回的亲缘关系最近。RT-qPCR分析显示,MiUGT79B1和MpUGT79B1均在花蕾期高表达,MiUGT79B1表达趋势为先降低后升高,MpUGT79B1表达趋势为先降低后保持平缓。2种花色绿绒蒿UGT基因表达水平与总黄酮累积模式均呈显著正相关。结果为进一步深入研究MiUGT79B1和MpUGT79B1基因在绿绒蒿花瓣呈色中的功能及其花色分子育种提供理论基础。

基于农杆菌介导法将CP4-EPSPS基因转入玉米自交系B73的研究

【目的】建立玉米遗传转化体系培育抗除草剂玉米材料,解决玉米杂草危害问题。【方法】采用农杆菌介导法在玉米自交系B73幼胚中转入抗除草剂基因(CP4-EPSPS),通过PCR、qRT-PCR鉴定转基因植株;利用ddPCR技术筛选低拷贝转基因植株,并对低拷贝植株进行草铵膦抗性鉴定。【结果】在所获得的181株抗性植株中12株为阳性,转基因植株的外源抗除草剂基因(CP4-EPSPS)在转录水平上均能正常表达;转基因植株中筛选到低拷贝植株5株;抗性鉴定证明转基因植株均具有草铵膦抗性。收获T1代转基因低拷贝植株种子5份。【结论】建立了以B73为受体,基于农杆菌法介导的玉米遗传转化体系。

亚麻生氰糖苷合成关键酶CYP79基因家族的鉴定及表达分析

CYP79蛋白是生氰糖苷合成关键酶,但关于亚麻CYP79基因的研究鲜有报道。本研究对包括亚麻在内的9种作物的CYP79基因家族进行了鉴定,并分析了亚麻CYP79基因的序列特征、复制事件、共线性关系、系统进化、顺式作用元件及表达模式。结果表明,在亚麻、白亚麻、毛果杨、木薯、芝麻、高粱、大豆、葡萄及水稻中分别鉴定到9、9、3、2、5、7、6、16和4个CYP79家族成员;系统进化分析显示,CYP79基因的进化具有物种特异性;LuCYP79不均匀分布在4条染色体上,具有1~3个外显子,其启动子区含大量激素与逆境响应相关元件;共克隆到8个亚麻CYP79基因的全长DNA序列及5个成员的全长cDNA序列;LuCYP79蛋白序列长度为282~565aa,等电点为5.84~9.14,分子量为31.56~62.86kD,均为亲水性蛋白,定位于内质网;共有5对基因发生复制事件,占全部基因的77.8%,全部经历了强烈的纯化选择,其中LuCYP79-1和LuCYP79-9在拟南芥和木薯中均具有同源基因。表达分析表明,LuCYP79家族成员具有组织特异性,且各成员在不同遗传背景下表达模式不同,其中LuCYP79-1、LuCYP79-7、LuCYP79-8和LuCYP79-9在4个品种中的表达差异显著。相关分析表明,50d时的LuCYP79-1/LuCYP79-7与成熟亚麻籽中生氰糖苷含量呈极显著正相关,20d时的LuCYP79-7/LuCYP79-8及(LuCYP79-7+LuCYP79-9)/LuCYP79-8分别与成熟亚麻籽中生氰糖苷含量呈极显著正相关,初步推测其可能是亚麻籽生氰糖苷合成的关键基因。研究结果对进一步阐明亚麻CYP79蛋白的功能具有积极意义,并为培育低生氰糖苷亚麻品种提供了理论参考。

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2,采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中,对T0代1 542株植株进行草甘膦喷洒实验,共得到32株能够耐受0.25%草甘膦药液的抗性植株;对这32株抗性植株的PCR检测结果表明,其中29株为PCR阳性植株,平均转化率为1.88%;Southern杂交和W estern杂交检测结果证明mG2-epsps基因已整合至玉米基因组并正确表达。

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cp4-epsps合成酶基因(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在65℃保温30 min,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。

基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。

进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆中CP4-EPSPS基因的检测比较研究

由于国际上对转基因产品的安全性存在较大争议 ,因此对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大。本研究以进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆为材料 ,通过比较分析外源的CP4 EPSPS基因的核苷酸序列和表达的氨基酸序列 ,设计出两对不同的引物 ,采用PCR方法分别对转基因油菜籽和大豆中外源的CP4

以耐草甘膦2mG2-epsps基因为选择标记的玉米转化体系的建立

转化细胞的筛选和再生是植物遗传转化体系中重要的组成部分,筛选剂的选择和筛选压力的高低直接影响着外源基因的转化率。以草甘膦异丙胺盐为筛选剂,通过比较在不同的草甘膦浓度及筛选时间的条件下,玉米愈伤组织生长和分化情况,发现经1mM的草甘膦异丙胺盐筛选15d后玉米愈伤组织分化受到明显抑制,故以此作为玉米遗传转化实验中的筛选压力。通过基因枪轰击,将构建好的pMAGUHM载体(其上携带有抗草甘膦基因2mG2-epsps基因)转化到玉米愈伤组织,利用草甘膦筛选得到耐草甘膦植株80株,其中PCR检测阳性植株为36株,转化率为45%。

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT-PCR、Western杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03μg/g鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。

棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位

以抗草甘膦陆地棉品系G-6和不抗草甘膦海岛棉品系海7124为试验材料,对分离世代进行检测,分析抗性基因的遗传规律;利用覆盖棉花26条染色体的234对核心引物,通过群体分离分析法进行差异性标记筛选,利用F2分离群体对抗性基因进行染色体定位。结果表明,抗草甘膦性状是受1对显性基因控制的质量性状。特异引物检测显示控制抗草甘膦性状的基因为人工合成基因CP4-EPSPS。利用筛选获得的27对多态性引物检测F2作图群体每个单株的基因型,发现分子标记NAU5417、NAU1339、BNL3992、BNL2448、NAU2140与目的基因CP4-EPSPS连锁。进一步筛选,共得到15个分子标记。参照现有的遗传图谱,推断目的基因CP4-EPSPS位于棉花第5染色体BNL2448与NAU2140之间,遗传距离分别为7.0 cM和16.2 cM。

CP4-EPSPS转基因棉花植株鉴定方法比较分析

CP4-EPSPS是从土壤农杆菌CP4菌株中分离得到的抗除草剂草甘膦基因,是转基因植物研究中最为常用的一种筛选标记基因。但是在CP4-EPSPS转基因植物后期筛选过程中仅凭简单的草甘膦抗性筛选并不能得到完全准确的鉴定结果,常会出现假阳性或漏选的情况。本研究以抗草甘膦转CP4-EPSPS基因棉花为材料,对PCR扩增、ELISA、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条及草甘膦抗性四种转基因阳性植株筛选方法进行比较,从筛选结果的准确性、时效性、易用性及实惠性等不同方面综合分析了各种筛选方法的优缺点,结果表明ELISA、试纸条检测方法的准确性显著高于PCR检测与0.3%浓度草甘膦抗性检测,而试纸条检测操作更加便捷,因此建议将草甘膦抗性与试纸条检测方法结合起来使用。本研究结果为以CP4-EPSPS基因为标记筛选的转基因植物的室内及大田筛选提供实验依据。

通过玉米茎尖转化耐草甘膦基因2mG2-epsps及抗性鉴定

以X2211、78599等10个优良玉米自交系的茎尖为受体材料,采用农杆菌介导和真空负压法将抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米茎尖生长点分生组织细胞,转化后的茎尖经共培养3 d,植入花盆,3叶1心经除草剂（glyphosate,草甘膦）筛选,产生耐草甘膦1‰~1.25‰植株,移栽大田。从种子萌发准备茎尖到转化苗喷施除草剂筛选、移栽大田,整个周期只需30 d左右。同时,经特异PCR检测表明：2mG2-epsps基因已整合进部分植株。

转2mG2-epsps基因耐草甘膦玉米T抗-4对非靶标除草剂的耐受性评价

【目的】以优异的耐草甘膦转基因玉米转化体T抗-4和未转化的受体自交系18599为材料,开展T抗-4综合农艺性状评价以及对非靶标除草剂的耐受性评价。【方法】对田间主要农艺性状表型及产量性状进行调查和分析。【结果】T抗-4主要农艺性状与18599相比,在植物形态学上基本无差异。本研究选取常规玉米田间普遍施用的除草剂烟嘧磺隆和硝磺草酮-莠去津,常规玉米敏感的除草剂精喹禾灵以及非选择性、灭生性除草剂草铵膦作为非靶标除草剂,通过人工喷施1和2倍的田间推荐剂量,在田间受控环境下评价T抗-4对非靶标除草剂的耐受性表明:上述非靶标除草剂对受体植株18599和玉米转化体T抗-4的影响表现一致。【结论】第一,转化体和非转基因对照除了在目标性状草甘膦抗性方面具有显著差异之外,非靶标除草剂的耐性表现具有等同性;第二,在农业生产中,耐草甘膦的转基因玉米T抗-4可以通过常规的玉米敏感除草剂精喹禾灵和非选择性除草剂草铵膦进行防治和杀灭,保障了转化体的环境安全。本试验为玉米转化体T抗-4的环境等安全评价提供了基础试验数据。

转CP4-EPSPS基因大豆对大鼠的致突变研究

以SD大鼠为试验动物模型,分别饲喂含转CP4-EPSPS基因大豆和常规大豆饲料,以转基因大豆饲料饲喂大鼠为试验组,常规大豆饲料饲喂大鼠为对照组,择期进行精子畸变试验、显性致死试验和致畸试验。结果表明:试验组和对照组相比精子畸变率无显著差异(P>0.05),二者与阳性对照组差异显著(P<0.05);显性致死试验中试验组与对照组胚胎死亡率无显著差异(P>0.05);致畸试验中2组活胎同性别间的体质量、体长、尾长、前肢长度均无显著差异,经活胎外表检查、骨骼检查、内脏检查无畸形。结果说明,喂食转CP4-EPSPS基因大豆饲料对大鼠精子畸变、胚胎致死、胎仔畸形无不良影响,不存在生殖毒性。

转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33转化体特异性检测方法的建立

转g 10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33是由浙江大学研发的耐除草剂大豆品系,目前已进入生产性试验阶段。到目前为止尚无文献报道对该转基因新品种的检测方法,因此亟需建立精准的定量检测方法为农业转基因生物安全管理提供技术支持。根据耐除草剂大豆ZUTS-33品系外源基因插入位点特异序列设计引物和TaqMan探针,利用优化的实时荧光定量PCR检测方法评价该引物对和探针的特异性、准确度、精确度和重复性,并确定此检测方法的检测极限(limit of detection,LOD)和定量极限(limit of quantity,LOQ)。实验结果显示,研究所建立的转基因大豆ZUTS-33转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法具有高度的品系鉴定特异性,准确度、精确度均符合要求,重复性较好,且检测方法的LOD达到20拷贝,LOQ达到40拷贝。研究结果为转g 10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33的身份识别和检测监测提供了有效的方法。

激光诱导荧光结合磁分离检测CP4-EPSPS基因

建立一种激光诱导荧光结合磁分离的检测技术,用于在线检测CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因(CP4-5-enol acetate-3-phosphate synthase gene,CP4-EPSPS)。以氨基磁纳米粒子(magnetic nanoparticles,MNPs)为载体修饰cDNA,构建捕获基因探针,并设计FAM荧光标记的信号基因探针(sDNA)。在目的基因CP4-EPSPS(tDNA)存在的情况下,cDNA和sDNA通过碱基互补配对原则与tDNA结合形成双链结构。该结构通过毛细管时被磁场富集分离,然后在激光诱导荧光检测器的作用下在线检测其荧光信号。通过对MNPs质量浓度、捕获探针浓度、牛血清白蛋白质量浓度进行考察,在优化的实验条件下,在1.0×10^(-11)~2.0×10^(-7)mol/L范围内,CP4-EPSPS基因浓度与荧光峰面积呈良好线性关系,检出限为4.0×10^(-12)mol/L(RSN=3),该方法成功应用于转基因大豆的聚合酶链式反应扩增产物的检测。

膨化对转基因豆粕CP4-EPSPS蛋白的影响

旨在研究转基因豆粕经挤压膨化后外源蛋白的变化规律。以CP4-EPSPS多克隆抗体和转基因含量为2%的大豆标准品作为材料,建立ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4-EPSPS蛋白的方法。结果表明,膨化豆粕中外源蛋白含量随着温度和含水率的升高逐渐降低,ELISA法检测低限达到0.25%,可以定量检测经过加工的转基因豆粕。