非酒精性脂肪性肝炎AML-12体外模型建立

目的分析并评价不同比例浓度梯度OA/PA诱导的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)炎症体外模型。方法通过采用不同比例浓度梯度OA/PA(2∶3或2∶1)诱导AML-12细胞建立NASH炎症体外模型;收集细胞OA/PA(500μmol/L∶250μmol/L)诱导AML-12株CCK-8检测细胞毒性或存活率;油红O染色观察其胞内脂肪变性;qRT-PCR或Western blotting检测细胞内TNF-α、IL-6和TGF-β1 mRNA含量。结果得出不同比例浓度的OA/PA混合药物刺激24 h或48 h后,OA/PA以2∶1比例(500μmol/L+250μmol/L)等摩尔比混合后,细胞毒性明显低于2∶3的OA/PA(200μmol/L+300μmol/L)浓度(P<0.05);刺激48 h后,模型组细胞内脂滴及IL-6和TNF-αmRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论以2∶1比例的OA(500μmol/L)/PA(250μmol/L)混合药物诱导下成功建立NASH炎症AML-12体外模型。

Vimentin、CK34βE12在前列腺增生组织中表达的研究

目的:探讨CK34βE12与Vimentin在前列腺增生组织中的表达及前列腺炎与前列腺增生的关系。方法:利用HE染色观察正常前列腺组织及前列腺增生组织中炎细胞的浸润情况。利用免疫组织化学方法检测CK34βE12与Vimentin在正常前列腺组织与前列腺增生组织中的表达情况。结果:正常前列腺组织中无炎细胞浸润,前列腺增生组织中炎细胞浸润的阳性率为87.2%。CK34βE12在有无炎细胞浸润的前列腺增生组织中的表达无显著性差异,而Vimentin的表达有显著性差异(P<0.05)。结论:前列腺炎症能导致前列腺增生的发病,且由炎症所造成的前列腺增生主要是间质细胞的增生。

β2-spectrin的siRNA对AML-12肝细胞增殖特性的影响

目的应用特异性siRNA干扰小鼠肝细胞株AML-12中β2-spectrin表达,检测AML-12细胞增殖凋亡以及细胞周期的改变。方法化学合成β2-spectrin特异性siRNA,分别转染AML-12细胞,荧光定量PCR和Western blot确定其抑制效果。AML-12细胞经TGF-β细胞因子处理4h后,转染β2-spectrin特异性siRNA,48h后,BrdU标记法以及流式细胞术检测β2-spectrin沉默前后AML-12细胞增殖、凋亡以及周期变化;共聚焦技术检测干扰β2-spectrin表达对TGF-β/Smad信号通路中Smad3、Smad4核定位的影响。结果 siRNA可以高效特异沉默β2-spectrin的表达。流式细胞术检测显示,β2-spectrin沉默促进AML-12细胞增殖,抑制凋亡,S期细胞比例显著升高。免疫荧光结果显示,TGF-β处理后,Smad3、Smad4表达定位于细胞核,沉默β2-spectrin干扰Smad3、Smad4细胞核内定位。结论沉默β2-spectrin的表达促进AML-12增殖,抑制凋亡,促进细胞向S期转化。其机制可能是通过干扰Smad3、Smad4核定位而抑制TGF-β/Smad信号通路,进而发挥诱导凋亡效应。

胚胎干细胞分泌因子增强AML-12细胞抗凋亡能力

目的:研究胚胎干细胞分泌因子是否能增强AML-12细胞在恶劣条件培养下的抗凋亡能力。方法:分别用胚胎干细胞完全培养基(CON-M)和胚胎干细胞上清液(ESC-M)培养AML-12细胞,并置于恶劣细胞培养环境中培养,MTT法比较各组AML-12细胞活力;Seahorse细胞代谢分析仪比较各组AML-12细胞氧消耗率以及细胞外酸化率等呼吸功能代谢情况。结果:MTT结果显示在恶劣细胞培养环境中,于ESC-M中培养的AML-12细胞拥有更强的抗凋亡能力。Seahorse细胞代谢分析显示ESC-M培养能加强AML-12细胞糖酵解潜力、最大氧化呼吸能力以及氧化呼吸潜力。结论:胚胎干细胞分泌因子能够增强AML-12细胞在恶劣培养条件下的抗凋亡能力。

荷叶碱对小鼠肝AML-12细胞内脂质代谢的影响

该研究通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定荷叶中荷叶碱含量,对比分析25种荷叶中荷叶碱含量差异,并利用油酸诱导建立AML-12细胞脂质蓄积模型,研究荷叶碱对脂质代谢的影响。通过测定甘油三酯(Triglyceride,TG)含量和油红O染色情况,评估细胞脂滴蓄积情况;检测细胞内AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5‘-Monophosphate-Activated Protein Kinase,AMPK)通路相关蛋白表达水平,探究荷叶碱影响脂质代谢的作用机制。经HPLC检测,发现荷叶品种间荷叶碱含量差异显著,其中佛座莲的荷叶碱质量分数最高,达0.68 mg/g,而金凤的荷叶碱质量分数最低,仅为0.22 mg/g。在脂质代谢研究中,与对照组相比,模型组在建模后脂滴数量显著增加,TG含量提升(P<0.01),P-AMPK和脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose Triglyceride Lipase,ATGL)在蛋白水平上表达显著降低(P<0.05);在荷叶碱的干预下,AML-12细胞的脂滴蓄积程度明显降低,TG含量显著减少(P<0.05),P-AMPK和ATGL的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。由此表明:不同荷叶品种间荷叶碱含量存在明显差异,荷叶碱可能是通过调控AMPK/ATGL途径调节AML-12细胞内脂质代谢。该结果可为荷叶的开发利用提供理论支持。

波形蛋白影响PC12细胞神经分化的研究

目的探究波形蛋白分子在PC12细胞神经分化中的作用。方法用免疫印迹方法检测PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达情况。用免疫印迹方法检测PC12H细胞和PC12L细胞在NGF处理前后波形蛋白的表达情况。构建波形蛋白干扰质粒,用免疫印迹方法检测该质粒的干扰效果。分别将对照质粒、波形蛋白干扰质粒瞬时转染PC12H细胞,培养0、1、2、3天观察与记录细胞的分化情况,用Image-pro plus软件定量分析这两组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比例。结果 PC12H细胞中波形蛋白的表达明显高于PC12L细胞(P=0.000)。NGF处理后PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达量均增加,且在PC12L细胞中更明显(P=0.000)。波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞中波形蛋白的表达(P=0.000)。瞬时转染波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞的神经分化,定量分析结果显示干扰组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比均明显小于对照组,差异均有统计学意义(P=0.000)。结论波形蛋白分子可以促进PC12细胞的神经分化。

PHP14通过与Vimentin相互作用影响TGF-β诱导的肝细胞AML-12上皮-间质转化

目的:探讨PHP14在上皮-间质转化中的作用及其可能作用机制。方法:建立了研究上皮-间质转化的细胞模型小鼠肝细胞AML-12。在AML-12中过表达PHP14,通过光学显微镜进行形态学观察,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测AML-12上皮-间质转化中相关标志物的表达情况。通过免疫共沉淀检测PHP14与Vimentin的相互作用情况。结果:小鼠肝细胞AML-12可作为研究上皮-间质转化的较好细胞模型。在AML-12中过表达PHP14可促进AML-12细胞的上皮-间质转化,并增强其运动能力。过表达PHP14可上调Vimentin的蛋白质水平,而对其他上皮-间质转化相关标志物表达没有影响。进一步的研究发现,PHP14可与Vimentin相互作用。结论:PHP14通过与Vimentin相互作用,稳定Vimentin的蛋白质水平,从而参与并调节上皮-间质转化。

苦丁冬青苷D抑制肝细胞脂质沉积作用及机制

目的探讨苦丁冬青苷D(kudinoside D,KD-D)对棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导肝细胞脂质沉积的影响。方法体外培养AML-12细胞,随机分为Control组、PA组、PA+KD-D 20μmol·L^(-1)组、PA+KD-D 40μmol·L^(-1)组和PA+KD-D 80μmol·L^(-1)组。除Control组外,其他各组细胞加入PA(0.4 mmol·L^(-1))孵育24 h,KD-D在PA加入前1 h给予。MTT法检测细胞存活率;油红O染色和透射电子显微镜检测肝细胞脂质沉积;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧族;MitoSOX线粒体超氧化物红色荧光探针检测细胞线粒体超氧化物。结果不同浓度KD-D明显改善PA诱导的肝细胞形态学改变。与Control组比较,PA组细胞内红色脂滴明显增加;与PA组比较,KD-D不同浓度干预的细胞内红色脂滴减少。透射电子显微镜结果提示,KD-D减少PA诱导的肝细胞脂肪变性并改善超微结构。此外,KD-D明显降低PA诱导的细胞活性氧水平(P<0.01),降低细胞线粒体超氧化物含量(P<0.01)。结论KD-D可抑制PA诱导的肝细胞脂质沉积,其机制可能与调控氧化应激反应有关。

5种食用菌水提物生物活性的比较

目的:探究并对比草菇、灰树花、红菇、鸡腿菇、树舌5种食用菌水提物的抗氧化、免疫及辐射防护作用,为食用菌的开发利用提供理论依据。方法:采用苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法、福林-酚法及氯化铝法分别检测5种食用菌水提物中总糖和粗多糖、总蛋白、总酚、总黄酮的质量分数;以2,2’-联氨-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)阳离子自由基清除能力、2,2-联苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、羟自由基清除能力、总还原力4种抗氧化活性指标研究食用菌水提物的体外抗氧化能力;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测食用菌水提物对巨噬细胞RAW264.7的促增殖活性;并以60Coγ辐射氧化损伤小鼠肝细胞AML-12为模型,探究5种食用菌水提物的体外辐射防护作用。结果:草菇、灰树花、红菇、鸡腿菇、树舌5种食用菌水提物的主要成分中总糖含量占比最高,相应的总糖质量分数分别为(80.90±1.20)%、(67.00±2.48)%、(55.31±0.55)%、(84.87±7.31)%和(58.19±1.50)%。粗多糖质量分数结果显示,灰树花提取物粗多糖含量最高,其粗多糖质量分数为(61.28±2.95)%。5种食用菌水提物均具有良好的抗氧化能力,其中树舌水提物的抗氧化活性最佳。此外,不同质量浓度(10~200μg/mL)的5种食用菌水提物均能一定程度促进巨噬细胞RAW264.7的增殖,相比之下,低质量浓度树舌水提物对巨噬细胞的增殖促进作用更显著。体外辐射防护作用结果表明,在实验质量浓度范围内(10~200μg/mL),草菇水提物对60Coγ辐射所致的AML-12细胞存活率下降具有明显的改善作用,而树舌水提物在低质量浓度时也同样具有显著的辐射防护作用。结论:5种食用菌水提物具有不同的生物活性,综合比较树舌水提物的抗氧化活性、免疫调节作用和抗辐射功能均较好,值得进一步深入研究。