漆酶基因LACC1经腺苷酸活化蛋白激酶/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3加重脑梗死缺血再灌注损伤的机制研究

目的探讨漆酶基因LACC1对脑梗死后缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法①采购C57BL/6J LACC1基因敲除(LACC1-/-)小鼠20只,野生型小鼠20只,建立大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型各15只,比较两组小鼠的脑梗死体积。采用蛋白质免疫印迹实验检测脑组织中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylate AMP-activated protein kinase,p-AMPK)及NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)水平,采用微阵列分析外周血中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)表达谱及探讨可能涉及的信号转导通路。②制备小鼠小胶质细胞氧糖剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,并通过小干扰RNA(siRNA)转染技术上调及抑制LACC1的表达,明确LACC1对脑梗死体外模型炎症和氧化应激的调节作用。采用蛋白质免疫印迹实验检测p-AMPK、NLRP3水平,采用酶联免疫吸附测定法检测血清过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、IL-1β、IL-6、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、TNF-α水平。结果MCAO/R模型野生型小鼠组脑梗死体积比例为(21.38%±4.06%),LACC1-/-小鼠组脑梗死体积比例为(19.07%±2.86%),差异有统计学意义(P=0.041),同时LACC1-/-小鼠脑组织中p-AMPK的蛋白表达水平增加,NLRP3蛋白表达水平受到抑制。OGD/R细胞模型中,LACC1的下调抑制了NLRP3蛋白的表达、增加了p-AMPK蛋白的表达。OGD/R细胞模型中,LACC1的过度表达增加了IL-1β、IL-6、INF-γ、TNF-α、MDA和ROS生成,降低了CAT和SOD的水平(P<0.05)。结论LACC1可能通过AMPK/NLRP3途径加重小鼠缺血再灌注后的炎症反应,这可能为脑梗死或其他神经系统疾病及其相关并发症提供一种新的治疗方案。

二甲双胍激活腺苷酸活化蛋白激酶抑制心肌缺氧再灌注损伤介导的NOD样受体蛋白3炎症体活化的研究

目的:评价腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)介导的NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症体活化在二甲双胍后处理保护心肌缺氧再灌注(H/R)损伤中的作用及机制。方法:选取健康雄性SD大鼠64只,进行麻醉,开胸直接取心脏,将心脏悬挂在Langendoff灌注装置上建立离体心肌缺氧再灌注模型。随机分为4组(n=16):持续灌注组、缺氧再灌注组(H/R组)、二甲双胍后处理组(MET组)、二甲双胍后处理+AMPK抑制剂(CC)组(MET+CC组)。各组进行相应处理后,监测血流动力学指标,测定心肌梗死面积,观察心肌细胞超微结构,ELIS法测定心肌组织内乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,心肌组织原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡发生;蛋白免疫印迹(Western blot)法测定磷酸化AMPK、AMPK、NLRP3、活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)、IL-1β和GAPDH蛋白表达水平。结果:与持续灌注组比较,H/R组心肌梗死面积增大(P<0.05),LDH、CK-MB水平增加(P<0.05),心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与H/R组比较,MET组心肌梗死面积缩小(P<0.05),LDH、CK-MB水平降低(P<0.05),心肌细胞凋亡率下降(P<0.05),磷酸化AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),而NLRP3、活化caspase-1和IL-1β表达显著下降(P<0.05);与MET组比较,MET+CC组抑制AMPK激活后心肌梗死面积进一步增大(P<0.05),LDH和CK-MB水平进一步升高(P<0.05),心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05);磷酸化AMPK/AMPK比值降低(P<0.05),而NLRP3、活化caspase-1和IL-1β表达显著升高(P<0.05)。结论二甲双胍通过激活AMPK信号通路,抑制心肌内NLRP3炎症体活化,从而减轻离体大鼠心肌缺氧再灌注损伤。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

牡荆素调控AMPK/NLRP3途径介导的细胞焦亡对大鼠急性咽炎的作用机制研究

目的:基于AMPK/NLRP3信号通路探究牡荆素对大鼠急性咽炎的影响及其调控机制。方法:60只SD大鼠随机分为对照组、模型组、阿莫西林组和牡荆素低、中、高剂量组,每组各10只。除对照组外,其余各组大鼠均采用咽部定向喷射25%氨水的方法构建急性咽炎模型。牡荆素各剂量组大鼠分别腹腔注射3、6、12 mg/kg牡荆素;阿莫西林组大鼠给予0.36 g/kg阿莫西林灌胃;其余腹腔注射等量0.9%生理盐水。各组大鼠于给药干预7 d后进行行为状态评分、咽部组织病理学染色观察,并进行血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE_(2)检测,筛选出牡荆素最佳给药剂量;同时检测咽部组织焦亡相关蛋白及AMPK/NLRP3表达。随后将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、牡荆素组(腹腔注射12 mg/kg牡荆素)、牡荆素+CC(AMPK抑制剂)组(腹腔注射12 mg/kg牡荆素后,立刻注射20 mg/kgCC),每组各10只。除对照组外,其余各组大鼠均采用咽部定向喷射25%氨水的方法构建急性咽炎,造模后使用相应药物干预,1次/d,共干预7 d。苏木素-伊红(HE)染色观察咽部组织病理学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE_(2)水平;Western blot检测咽部组织AMPK/NLRP3通路及细胞焦亡相关蛋白表达。结果:与模型组相比,牡荆素各剂量组大鼠行为状态评分均显著降低(P<0.05),血清IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE_(2)水平降低(P<0.05),咽部组织病理性损伤明显减轻,且呈剂量相关性,筛选得出牡荆素12 mg/kg为最佳给药剂量。与模型组相比,牡荆素组大鼠咽部组织p-AMPK蛋白阳性率明显升高,NLRP3蛋白阳性率明显降低,细胞焦亡相关蛋白表达明显降低(P<0.05)。与牡荆素组相比,牡荆素+CC组大鼠咽部组织损伤程度加重,血清IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE_(2)水平,细胞焦亡相关蛋白和NLRP3蛋白表达显著升高,p-AMPK/AMPK降低(P<0.05)。结论:牡荆素能够通过调控AMPK/NLRP3信号通路,抑制细胞焦亡,进而改善大鼠急性咽炎。

桃叶珊瑚苷通过AMPK/NLRP3通路对心肌梗死大鼠心功能的影响及机制

目的观察桃叶珊瑚苷对心肌梗死(MI)大鼠的心功能的影响,并探讨AMP活化激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)通路在其中的作用机制。方法60只SD大鼠均分为假手术(Sham)组、MI模型组、MI+桃叶珊瑚苷组及MI+桃叶珊瑚苷+抑制剂组组,Sham组大鼠做手术但不结扎冠脉血管、后3组大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠MI模型,前2组大鼠手术后灌胃生理盐水、后2组大鼠手术后分别灌胃100 mg/kg桃叶珊瑚苷、100 mg/kg桃叶珊瑚苷+0.2 mg/kg AMPK抑制剂Dorsomorphin(CC)、均14 d;记录各组大鼠左室射血分数(LVEF)、左室收缩压(LVSP)、左室收缩末期容积(LVESV)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室舒张压(LVEDP)、左室舒张末期容积(LVEDV),红四氮唑(TTC)-伊文思蓝(EB)及免疫荧光法检测心肌梗死体积和心肌细胞焦亡比例,苏木素伊红(HE)染色观察心肌细胞形态,ELISA法检测心肌匀浆中白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-18及乳酸脱氢酶(LDH)水平,Werstern blot法检测心肌组织AMPK、凋亡半胱氨酸酶前体(pro-caspase1)、p-AMPK、cleaved-caspase1、NLRP3、凋亡斑点样蛋白(ASC)及胃泌素D-N(GSDMD-N)蛋白表达。结果Sham组大鼠心肌无梗死、细胞形态及排列正常,MI组出现心肌梗死、心肌细胞增大且排列混乱、有大量炎症细胞;与Sham组相比,MI组、MI+桃叶珊瑚苷+抑制剂组大鼠LVEF、LVSP、LVFS、p-AMPK/AMPK蛋白水平降低(P<0.05),LVESV、LVEDP、LVEDV、心肌梗死体积、心肌细胞焦亡比例、IL-1β、IL-18、LDH及ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1、GSDMD-N蛋白水平升高(P<0.05);与MI组相比,MI+桃叶珊瑚苷组大鼠LVEF、LVSP、LVFS、p-AMPK/AMPK蛋白水平升高(P<0.05),LVESV、LVEDP、LVEDV、心肌梗死体积、心肌细胞焦亡比例、IL-1β、IL-18、LDH及ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1、GSDMD-N蛋白水平降低(P<0.05);与MI+桃叶珊瑚苷组相比,MI+桃叶珊瑚苷+抑制剂组大鼠LVEF、LVSP、LVFS、p-AMPK/AMPK蛋白水平降低(P<0.05),LVESV、LVEDP、LVEDV、心肌梗死体积、心肌细胞焦亡比例、IL-1β、IL-18、LDH水平及ASC、NLRP3、cleaved/pro-caspase1、GSDMD-N蛋白水平升高(P<0.05)。结论桃叶珊瑚苷可改善MI大鼠心功能,其机制可能与活化AMPK、抑制NLRP3小体形成、减轻心肌细胞炎症和焦亡有关。

基于AMPK/mTOR/NLRP3信号通路探究复方黄柏液对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症的影响

目的基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)通路探究复方黄柏液(CCPF)对痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症的影响。方法大鼠分为NC组、Model组、CCPF组(5 ml)、CCPF+compound C(AMPK抑制剂)组(5 ml CCPF+0.25 mg/kg compound C)、CCPF+MHY1485(m TOR激活剂)组(5 ml CCPF+10 mg/kg MHY1485),每组12只。除NC组外,其它组大鼠均需向右耳皮内注射痤疮丙酸杆菌混悬液以构建痤疮模型。建模成功后,进行给药处理,每天1次,持续14 d。观察各组大鼠耳部炎症、红肿情况;利用游标卡尺测量大鼠右耳耳廓的厚度,并计算耳廓肿胀率、耳廓痤疮数;HE染色检测耳廓组织病理变化并计数炎性细胞数;ELISA法检测大鼠血清中睾酮(T)、雌二醇(E2)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)水平;免疫组化检测大鼠耳组织中TNF-α、IL-8蛋白水平;Western blot检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)蛋白表达。结果与NC组比较,Model组大鼠耳廓组织红肿明显,注射部位有脓疱产生,血管充血及炎性细胞浸润明显,耳廓厚度、耳廓肿胀率、耳廓痤疮数、T、TNF-α、IL-8水平、p-mTOR/mTOR、NLRP3、caspase-1蛋白表达升高,E2、p-AMPK/AMPK水平降低(P<0.05);与Model组比较,CCPF组的上述指标均得到改善(P<0.05);compound C或MHY1485逆转了CCPF对痤疮丙酸杆菌诱导的大鼠皮肤炎症的改善作用。结论CCPF可能通过激活AMPK/mTOR通路来抑制NLRP3炎症小体的激活,从而改善痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤炎症。

槲皮素调控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路对大鼠分泌性中耳炎的作用机制

目的 探究槲皮素(quercetin, Que)对大鼠分泌性中耳炎(secretory otitis media, SOM)的作用及机制。方法 选取雄性SD大鼠48只,随机性分为对照组(Control)、模型组(Model)、Que组(100 mg·kg^(-1))、Que+p38 MAPK激动剂组(100 mg·kg^(-1)Que+2 mg·kg^(-1)Anisomycin),每组各12只。除Control组外,其余各组大鼠均采取腹腔注射卵清蛋白复制分泌性中耳炎大鼠模型,造模成功后,各组大鼠进行相应干预21 d。给药干预结束后,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠中耳组织形态学变化;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18及中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平;实时定量PCR (RT-qPCR)和Western blot检测中耳黏膜组织p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路相关mRNA及蛋白表达变化。结果 与Control组相比,Model组大鼠表现中耳内黏膜层增厚,伴有大量炎性细胞浸润,血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18及中耳灌洗液中IL-4增加,IFN-γ降低(P <0.01),中耳黏膜组织p-p38MAPK/MAPK、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved-caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白及mRNA表达水平均明显升高(P <0.01)。与model组相比,Que能够明显改善中耳内黏膜增厚,抑制炎性细胞浸润,降低TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、IL-4及中耳黏膜组织p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路mRNA和蛋白表达,升高IFN-γ(P <0.05或P <0.01)。与Que组相比,Anisomycin能够逆转Que对SOM大鼠的保护作用。结论 Que能够有效改善SOM发生、发展,其机制与抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路介导的炎性反应相关。

二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的观察二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法成年SD大鼠随机数字表法分为对照组、模型组和二甲双胍组,采用结扎左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。二甲双胍组大鼠建模前灌胃给于二甲双胍250 mg/kg,对照组和模型组给与等体积生理盐水。3组大鼠再灌注2 h后,采用生化酶法检测心肌损伤标志物酸激酶(CK-MB)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ);采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析大鼠心肌组织梗死面积和凋亡指数;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠心肌组织AMPK、NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-1表达水平。计量组数比较采用单因素方差分析。结果二甲双胍组大鼠心肌梗死比例[(26.14±4.71)%]明显低于模型组大鼠心肌梗死比例[(43.74±15.00)%],差异有统计学意义(t=3.540,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清CK-MB和cTnⅠ水平[(1821.88±213.52)U/L、(1.45±0.13)ng/L]明显低于对照组[(3100.87±149.41)U/L、(3.08±0.25)ng/L],差异有统计学意义(t=15.520、18.240,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌凋亡比例[(10.56±2.36)%]明显低于模型组大鼠心肌凋亡比例[(27.43±3.90)%],差异有统计学意义(t=11.710,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织磷酸化AMPK表达水平(1.22±0.11)明显高于对照组和模型组大鼠心肌组织(0.59±0.08、0.81±0.06),差异有统计学意义(t=14.370、10.510,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平(1.19±0.15、1.24±0.10)明显低于模型组大鼠心肌组织(1.78±0.12、1.82±0.16),差异有统计学意义(t=9.895、9.554,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(98.20±7.25)、(94.90±8.57)pg/ml]明显低于模型组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(148.70±15.33)、(156.10±21.03)pg/ml],差异有统计学意义(t=9.414、8.633,P<0.05)。结论二甲双胍通过激活AMPK,抑制NLRP3介导的炎性反应,对缺血再灌注损伤心肌起保护作用。

多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种好发于青春期及育龄期女性的涉及诸多因素的内分泌代谢性疾病,临床主要表现为闭经、体胖、多毛痤疮以及妊娠率显著降低,但目前其病因病机尚不清楚。胰岛素抵抗(IR)与多种慢性非传染性疾病(高血压、糖尿病、心脑血管疾病、PCOS等)相关,目前已知磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、肝激酶B1/AMP活化的蛋白激酶、沉默信息调节因子1/叉头框转录因子O1、Toll样因子4/核因子κB信号通路参与了PCOS伴IR(PCOS-IR)的作用机制,因此充分认识PCOS-IR的发病机制在疾病预防中有重要临床意义。

P38 MAPK/NF-κB/NLRP3对脑卒中大鼠模型对神经元的影响

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、核因子-κB(NF-κB)、核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白3信息通路(NLRP3)对脑卒中大鼠模型脑神经元的影响。方法将大鼠分为假手术组、模型组、p38 MAPK阻断剂(SB203580)组,分别干预2w,检测各组大鼠脑梗死体积百分比,Zea Longa分值,海马组织神经元的损伤和凋亡,以及海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6)和IL-1β的水平,p38 MAPK(p-p38 MAPK)中各主要蛋白表达。结果模型组脑梗死体积百分比相较于假手术组明显升高(P<0.05),p38 MAPK阻断剂组脑梗死体积百分比较模型组减少(P<0.05);模型组Zea Longa评分相较于假手术组明显升高,(P<0.05),p38 MAPK阻断剂组Zea Longa评分较模型组减少(P<0.05);p38 MAPK阻断剂组相较于模型组则呈明显的下降表现。模型组海马组织IL-6、L-1β和TNF-α水平相较于假手术组均明显升高(P<0.05);p38 MAPK阻断剂组相较于模型组呈现明显的下降(P<0.05)。模型组在p38 MAPK/NF-κB/NLRP3蛋白的表达上,相较于假手术组呈明显升高(P<0.05);p38 MAPK阻断剂组相较于模型组呈明显的下降(P<0.05)。结论阻断p38 MAPK可抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路,促使炎症反应进入受抑状态,弱化神经元凋亡表现,来发挥对缺血性脑卒中模型大鼠脑损伤的保护效果。

菊苣酸调控p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路对缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡及炎症反应的影响

目的分析菊苣酸(CA)对缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡、炎症反应的影响及其作用机制。方法采用改良线栓法制备缺血性脑卒中大鼠模型。将大鼠分为假手术组、模型组、CA组(10 mg/kg)、CA+p38 MAPK激活剂(Anisomycin)组(10 mg/kg CA+2 mg/kg Anisomycin),各组进行相应干预2 w,对大鼠进行Zea Longa评分和检测脑梗死体积百分比,尼氏(Nissl)染色检测大鼠海马组织神经元损伤,TUNEL法检测大鼠海马组织神经元凋亡,酶联免疫吸附法检测大鼠海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平,蛋白免疫印迹法检测大鼠海马组织磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、核因子-κB p65(NF-κB p65)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经元形态不规则、染色较浅,尼氏体数目明显减少,Zea Longa评分、脑梗死体积百分比、神经元细胞凋亡率、海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,CA组大鼠神经元形态明显改善,形态较饱满,染色均匀,尼氏体密集,Zea Longa评分、脑梗死体积百分比、神经元细胞凋亡率、海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3蛋白表达水平显著降低(P<0.05);Anisomycin可逆转CA对缺血性脑卒中大鼠的上述改善作用。结论CA可通过抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制炎症反应,减少神经元凋亡,缓解缺血性脑卒中引起的大鼠脑损伤。

大黄素调节AMPK/TXNIP/NLRP3信号通路对子痫前期大鼠炎症反应的影响

目的探究大黄素调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对子痫前期(PE)大鼠炎症反应的影响。方法通过皮下注射L-精氨酸甲酯(100 mg·kg^(-1))构建PE大鼠模型。将60只雌性大鼠随机分为对照组、模型组、大黄素组(40 mg·kg^(-1)大黄素)、Compound B10组(100 mg·kg^(-1) Compound B10)、大黄素+Compound B10组(40 mg·kg^(-1)大黄素+100 mg·kg^(-1) Compound B10),每组12只。对照组和模型组腹腔注射等量0.9%NaCl。收集24 h尿液,用考马斯亮蓝法测定总尿蛋白含量,用蛋白质印迹法检测AMPK/TXNIP/NLRP3信号通路蛋白水平。结果对照组、模型组、大黄素组、Compound B10组和大黄素+Compound B10组的总尿蛋白相对表达水平分别为(54.34±6.26)、(136.37±15.43)、(76.38±8.61)、(215.39±25.14)和(110.93±13.92)g·L^(-1),尿量分别为(10.59±0.92)、(15.38±1.49)、(11.51±1.13)、(21.49±2.50)和(14.71±1.49)mL,AMPK蛋白相对表达水平分别为0.63±0.06、1.57±0.18、0.81±0.09、2.34±0.23和1.38±0.15,TXNIP蛋白相对表达水平分别为0.33±0.04、0.79±0.08、0.49±0.10、1.13±0.12和0.82±0.09,NLRP3蛋白相对表达水平分别为0.46±0.05、0.83±0.09、0.56±0.07、1.25±0.14和0.78±0.08。模型组的上述指标与对照组、大黄素组、Compound B10组比较,大黄素+Compound B10组的上述指标与大黄素组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论大黄素可能通过抑制AMPK/TXNIP/NLRP3信号轴缓解PE大鼠炎症反应,从而改善胎盘损伤。

姜黄素通过p38 MAPK/NLRP3抑制肠道病毒71型诱导的细胞焦亡

肠道病毒-A71型(EV-A71)重症感染患儿多表现为过激的炎症反应,病毒感染引起的细胞焦亡可能是机体炎症发生的重要原因之一。本文旨在探究姜黄素对EV-A71病毒感染引起的细胞焦亡与细胞损伤的保护作用及可能的机制。首先,观察了姜黄素对EV-A71引起的细胞毒性的影响。CCK8检测结果显示,EV-A71感染降低细胞的增殖活力;LDH测定表明,病毒增加细胞培养上清中LDH的释放,造成了细胞的损伤;DAPI核染色及Dil细胞膜染色后观察到,EV-A71感染引起了细胞的形态变化和数量减少。姜黄素可以逆转病毒引起的上述变化,提示姜黄素对病毒感染的细胞毒性具有保护作用。细胞焦亡发生时,可促进炎症因子IL-1β的成熟、产生和释放。我们观察了EV-A71及姜黄素干预对细胞IL-1β产生的影响。Western印迹结果显示,病毒感染细胞内IL-1β的活化增加。ELISA检测结果显示,EV-A71病毒感染引起细胞上清中IL-1β的分泌水平增加;qPCR测定结果显示,EV-A71病毒感染细胞中IL-1β的转录水平上调;而姜黄素干预可抑制染毒细胞IL-1β的活化和分泌。Western印迹检测细胞内焦亡相关分子的变化。结果显示,EV-A71感染可诱导细胞发生焦亡,并呈时间和剂量依赖性,分子NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、GSDMD、胱天蛋白酶1(caspase-1)参与EV-A71诱导细胞发生的焦亡;姜黄素干预可以有效抑制EV-A71诱导的细胞细胞焦亡。另外,Western印迹检测显示,姜黄素可以减少细胞内EV-A71结构蛋白VP1的水平,通过检测细胞上清中病毒的CCID50发现,姜黄素可以降低细胞上清中病毒的滴度。最后,对姜黄素抗焦亡机制进行了探索,发现EV-A71感染诱导了细胞自噬并激活了p38/NLRP3通路,姜黄素能抑制自噬标志蛋白LC3及自噬底物p62的降解,并抑制p38/NLRP3的激活。总之,本研究明确了姜黄素通过对自噬溶酶体阶段及p38/NLRP3通路的抑制,有效减轻了EV-A71诱导的细胞焦亡,为姜黄素在抗EV-A71感染的临床应用提供参考。

苍膝通痹胶囊调控p38 MAPK/NLRP3/Caspase-1通路介导膝关节骨性关节炎软骨细胞焦亡的机制

目的:探究苍膝通痹胶囊(CXTB)调控p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)信号通路抑制膝关节骨性关节炎(KOA)软骨细胞焦亡的机制。方法:60只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、CXTB低、中、高剂量组及阳性药组,每组10只。使用改良Hulth法构建膝关节骨性关节炎大鼠模型,根据分组给予苍膝通痹胶囊(0.25、0.5、1.0 g·kg^(-1))及塞来昔布(24 mg·kg^(-1))灌胃,假手术组与模型组给予等体积生理盐水,连续灌胃28 d,1次/d。微计算机断层扫描(Micro-CT)检测骨体积分数(BV/TV)、骨小梁分离度(Tb.Sp),苏木素-伊红(HE)染色、番红固绿(SO)染色及国际骨关节炎研究协会(OARSI)评分观察膝关节退变水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、NLRP3、Caspase-1、消皮素D(GSDMD)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)炎性因子的含量。膝关节置换术后的软骨组织以Western blot检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达,Real-time PCR检测p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达。结果:Micro-CT显示,与假手术组比较,KOA大鼠关节间隙明显狭窄并见骨赘增生,BV/TV值减少、Tb.Sp值增加(P<0.01),血清中TNF-α、IL-1β、IL-18含量升高(P<0.01),软骨中p-p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达升高(P<0.01),p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达增强(P<0.01),与膝关节置换术后的正常软骨组织相比,病变软骨中的p-p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达升高(P<0.05),p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达增强(P<0.01)。HE染色及SO染色中可见KOA大鼠关节面粗糙,软骨厚度变薄,细胞排列无序杂乱,同时OARSI评分增加(P<0.01);与模型组比较,CXTB低、中、高浓度组大鼠膝关节的BV/TV值增加、Tb.Sp值减少(P<0.01),HE染色及SO染色可见关节面趋于平滑,OARSI评分减少(P<0.01),p-p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达降低(P<0.05),p38 MAPK、NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA的表达下降(P<0.01),血清中TNF-α、IL-1β、IL-18含量降低(P<0.01)。结论:苍膝通痹胶囊干预后可减缓KOA大鼠的膝关节退变并且抑制炎性因子的表达及软骨细胞焦亡从而保护软骨,而机制可能是通过p38 MAPK/NLRP3/Caspase-1信号通路来调控的。

基于AMPK/NLRP3通路介导的细胞焦亡探究牡荆素对大鼠分泌性中耳炎的抑制作用

目的探究牡荆素对分泌性中耳炎大鼠的影响及调控机制。方法将50只雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、牡荆素(3、12 mg/kg)组、牡荆素高剂量+AMPK抑制剂(Compound C)组,每组各10只。除对照组外,其余各组大鼠均采取内毒素法复制分泌性中耳炎大鼠模型。造模成功后,牡荆素3、12 mg/kg组分别ip相应剂量的牡荆素;牡荆素+Compound C组ip 12 mg/kg的牡荆素后,立即ip 20 mg/kg Compound C;对照组和模型组分别ip等量生理盐水。连续给药21 d后,苏木素–伊红(HE)染色观察中耳黏膜组织病理学改变;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)水平;听觉脑干诱发电位仪测定大鼠听力功能;Western blotting检测中耳黏膜组织腺苷酸活化蛋白激酶/NOD样受体蛋白3(AMPK/NLRP3)通路及细胞焦亡相关蛋白表达。结果与模型组相比,牡荆素3、12 mg/kg组大鼠中耳黏膜组织病理损伤减轻,中耳黏膜厚度、听力反应阈值、血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平均降低(P<0.05),细胞焦亡相关蛋白[Caspase-1 p20、焦亡执行蛋白消皮素D-N(GSDMD-N)、IL-1β、IL-18]及NLRP3蛋白表达下调,p-AMPK蛋白表达上调(P<0.05),且呈剂量相关性。与牡荆素12 mg/kg组相比,Compound C能够逆转牡荆素对上述指标的改变。结论牡荆素能够抑制分泌性中耳炎大鼠炎症反应,减轻中耳黏膜病理性损伤,其机制与抑制AMPK/NLRP3通路介导的细胞焦亡相关。

白杨素调控AMPK-NLRP3通路介导细胞焦亡对肝纤维化的保护作用

本研究探讨白杨素(chrysin)调控AMP活化激酶(AMP-activated kinase,AMPK)-NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)通路介导的细胞焦亡途径对肝纤维化的保护作用。体内实验采用腹腔注射硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)建立小鼠肝纤维化模型,除对照组和单独给药白杨素组外,其余组第1周腹腔注射TAA(100 mg·kg-1)3次,第2~5周腹腔注射TAA(200 mg·kg-1),每周3次。白杨素各给药组每天灌胃给药直至第5周。采用HE及Masson染色观察肝脏病理学变化,测量小鼠血清中天冬氨酸转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平。所有动物实验均经大连大学附属中山医院伦理委员会批准(DWLL2019060)。体外细胞实验采用转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导人肝星状细胞LX-2活化。Western blot法检测小鼠肝组织及LX-2细胞中AMPKα、p-AMPKα、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)蛋白水平,同时采用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测肝组织中I型胶原(collagen-I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18、caspase-1、GSDMD mRNA表达水平。体内实验结果表明,与对照组相比,TAA组小鼠血清AST、ALT水平升高,肝组织炎性细胞浸润并有大量胶原沉积,而白杨素给药组显著降低血清AST、ALT水平,并且肝脏形态、炎性细胞浸润及胶原、纤维阳性表达也呈剂量依赖性,优于TAA模型组。与TAA模型组相比,白杨素各给药组提高了AMPKα的磷酸化水平,抑制了NLRP3的表达。此外,白杨素各给药组抑制了IL-1β、IL-18、caspase-1及GSDMD蛋白表达及mRNA水平。体外细胞实验结果表明,白杨素能够抑制TGF-β诱导的肝星状细胞中collagen-I及α-SMA表达,增强AMPKα及其磷酸化水平,抑制NLRP3及GSDMD的蛋白表达。因此,白杨素可能通过激活AMPK抑制NLRP3炎性小体,减轻炎症和细胞焦亡,从而缓解肝纤维化进程。

IGF-1R调控乳腺癌细胞增殖和迁移的信号转导通路研究

目的：使用小分子抑制物LY294002和PD98059分别抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ PI3K）通路和有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）通路的信号转导，给予胰岛素样生长因子-1（IGF-1）刺激，检测乳腺癌细胞的增殖和迁移能力的变化。方法使用CCK-8法和体外迁移实验分别检测IGF-1干预下细胞的增殖能力，并以信号通路抑制剂处理后细胞作为对照组，同样使用CCK-8法和体外迁移实验检测其增殖能力。结果 IGF-1干预第2～4天，不同浓度IGF-1（20，50，100mg/L）均显著促进MDA-MB-231细胞增殖，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．05）；当IGF-1浓度为50mg/L时促进作用最明显；使用LY294002（25μM）或PD98059（50μM）分别阻断PI3K通路和MAPK通路后，不仅抑制MDA-MB-231细胞基础水平的增殖，而且抑制IGF-1刺激下的细胞增殖能力，与DMSO对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）；在不同浓度IGF-1（20，50，100mg/L）作用下，MDA-MB-231细胞迁移能力均增强，与对照组比较，差异有统计学意义（ P＜0．01）。结论 IGF-1干预后MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力明显增强，PI3K通路和MAPK通路均参与了IGF-1促进乳腺癌细胞增殖和迁移的信号转导。

非瑟酮调节AMPK/NLRP3信号通路对LPS诱导的牙周膜干细胞炎性损伤的影响

目的:研究非瑟酮(FIS)对脂多糖(LPS)刺激的人牙周膜干细胞(hPDLSC)炎性损伤的影响,并确定其潜在的分子机制。方法:CCK-8检测FIS单独或联合LPS处理hPDLSC的细胞活力。将hPDLSC分为对照组、LPS诱导(LPS)组、FIS治疗(LPS+FIS)组和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂(LPS+FIS+CC)组。ELISA评估炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β和IL-6水平;流式细胞术检测细胞凋亡水平。免疫印迹检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3以及NLRP3信号通路相关蛋白表达。结果:浓度40μmol/L的FIS可显著降低hPDLSC活力,20或40μmol/L FIS可明显恢复受LPS抑制的hPDLSC活力(P<0.05)。LPS刺激后hPDLSC上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高;细胞凋亡率升高,Bax和cleaved caspase-3的水平上调,Bcl-2水平下调;p-AMPK/AMPK和p-ACC/ACC比值和NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白水平均增加(P<0.05)。FIS处理后可明显改善LPS对hPDLSC炎症反应、细胞凋亡和AMPK/NLRP3信号通路的影响;而在AMPK激活剂处理后可部分逆转FIS对hPDLSC炎性损伤的保护作用。结论:FIS发挥的抗炎和抗凋亡作用使其成为保护hPDLSC免受牙周炎引起的损伤的潜在治疗药物。

骨关节炎相关信号通路的研究进展

骨关节炎是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病,其病因及发病机制尚不完全清楚。目前,国内外大量研究已证实骨关节炎的病理变化过程与众多信号通路有密切联系,其中部分信号通路与介导骨关节炎软骨破坏及调控软骨细胞凋亡有关,如p38丝裂原活化蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、Toll样受体等信号通路等;还有部分信号通路对骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡具有双重调节作用,如细胞外调节蛋白激酶、Notch、Wnt等信号通路。本文就骨关节炎相关信号通路的研究进展进行了综述。

NRG-1亚型及相关信号通路在周围神经疾病中的研究

神经调节蛋白-1（neuregulin-1，NRG-1）是一组含有表皮样生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）结构域的蛋白，其与酪氨酸激酶受体ErbB2（receptortyrosine-proteinkinaseerbB-2，ErbB2）结合后，激动下游的Ras蛋白／丝裂原活化蛋白激酶（rasprotein-mitogen—activatedproteinkinase，Ras—MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（phosphatidylinositOl3-phosphatekinase-proteinkinaseB，P13K-AKT）信号通路，从而促进施万细胞分化、增殖及迁移、髓鞘形成及神经修复。