玄参水提取物对高糖暴露条件下INS-1细胞AMPK的激活作用

目的研究玄参水提取物(AESN)对高糖(HG)条件下INS-1细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性的影响。方法将INS-1细胞培养于HG培养基中,并给予不同浓度AESN共孵育处理;利用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测AESN干预对细胞增殖/活力和焦亡小体形成的影响,使用Western blotting法观察AESN对细胞内AMPK表达及磷酸化水平的影响;利用时间分辨-荧光共振能量转移(TR-FRET)实验检测AESN对AMPK激酶活性的影响。结果CCK-8检测结果显示同正常培养条件相比,HG暴露显著降低INS-1细胞增殖/活力并增加焦亡小体形成数量,Western blotting检测结果表明HG暴露可导致细胞内AMPK磷酸化水平下降;而AESN共孵育可呈浓度依赖性地增加INS-1细胞增殖/活力、抑制焦亡小体形成并激活AMPK。TR-FRET实验结果表明,AESN可浓度依赖性增加AMPK激酶活性。结论AESN对HG暴露条件下INS-1细胞AMPK具有激活作用。

基于CREB3L1探讨矾冰纳米乳对兔耳增生性瘢痕模型相关蛋白及炎症因子的影响

目的观察矾冰纳米乳对兔耳增生性瘢痕组织环腺苷酸应答元件结合蛋白3样1(CREB3L1)及炎症损伤的影响,探讨其预防增生性瘢痕的作用机制。方法将30只新西兰大耳白兔随机分为空白组、模型组、积雪草苷组及矾冰纳米乳低、中、高剂量组(8.15、16.3、32.6 mg·mL^(-1))。采用热力烫伤法进行造模,深Ⅱ度烧伤造模成功后第14天给予相应药物外用,空白组、模型组外用等量生理盐水,每日2次,连续给药至第35天。苏木素-伊红(HE)染色观察兔耳瘢痕组织病理学改变;马松(Masson)染色观察瘢痕组织胶原沉积情况;免疫荧光双标法检测兔耳瘢痕组织CREB3L1/α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)共表达情况;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测瘢痕组织白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)等炎性因子表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测CREB3L1、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)、α-SMA mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western Bolt)检测CREB3L1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA的蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组瘢痕增生指数明显升高(P<0.01);病理学改变包括真皮层增厚,形成致密的网状纤维,伴见炎症细胞浸润;Masson染色可见真皮层增厚,蓝染的胶原纤维大量沉积排列紊乱;免疫荧光双标结果显示,瘢痕组织中CREB3L1阳性表达增加,α-SMA阳性表达增加,IL-6含量明显升高(P<0.01),IL-10含量明显降低(P<0.01),兔耳瘢痕组织中的CREB3L1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA mRNA相对表达量明显增加(P<0.01),CREB3L1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白的表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较,矾冰纳米乳中、高剂量组及积雪草苷组治疗后瘢痕增生指数均明显下降(P<0.05,P<0.01),病理改变可见真皮层变薄,炎性细胞均有不同程度减少,蓝染的胶原纤维减少,免疫荧光双染可见瘢痕组织中CREB3L1阳性表达降低,α-SMA阳性表达降低,IL-6含量明显降低(P<0.01),IL-10含量明显升高(P<0.01),矾冰纳米乳中、高剂量组和积雪草苷组均能够明显下调CREB3L1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA mRNA的表达(均P<0.01),降低CREB3L1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。结论矾冰纳米乳能够通过调节CREB3L1及相关纤维化蛋白的表达,降低炎症水平,从而预防增生性瘢痕形成,丰富了中医“既病防变”“治未病”思想的科学内涵。

鱼藤酮激活AMPK-ULK1信号通路诱导大鼠胸主动脉内皮细胞自噬

目的探讨鱼藤酮对大鼠胸主动脉内皮细胞(RTAEC)自噬的影响及其初步机制。方法选用60只雄性SD大鼠,随机分为对照(Con)组、二甲基亚砜(DMSO)组和鱼藤酮组[1、2、4 mg·(kg·d)^(-1)],各组分别干预28 d。实验前后分别记录大鼠体质量、血压和心率;HE染色观察胸主动脉和心脏组织病理生理改变,透射电镜观察其超微结构及自噬小体发生。细胞实验分组:Con组、DMSO组和鱼藤酮组(20、100和500 nmol·L^(-1)),分别处理24 h,用活性氧(ROS)和三磷酸腺苷(ATP)水平筛选鱼藤酮干预最佳浓度后,选取500 nmol·L^(-1)进行后续干预。腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)抑制剂化合物C(CC)在鱼藤酮处理前2 h干预细胞;RT-qPCR和Western blot检测胸主动脉自噬相关因子及腺苷酸激活的蛋白激酶-UNC-51样激酶1(AMPK-ULK1)通路的改变。结果与DMSO组相比,鱼藤酮组体质量增长量减少(P均<0.01);鱼藤酮对大鼠的血压和心率没有影响(P均>0.05);HE结果显示,鱼藤酮组胸主动脉内皮细胞伴有缺损,且心脏组织纤维排列紊乱、断裂;透射电镜结果发现,鱼藤酮组胸主动脉和心脏组织伴有结构异常及自噬小体出现;随着RTAEC鱼藤酮干预浓度增大,ROS产生水平增加(P<0.01),而ATP的生成减少(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与DMSO组相比,LC3和P62的mRNA表达水平均上调(P均<0.01);信号通路相关因子AMPK和ULK1的mRNA表达水平均增加(P均<0.01);加入AMPK抑制剂CC,Western blot检测自噬相关蛋白,与500 nmol·L^(-1)组相比,LC3表达降低(P<0.01),P62表达上调(P<0.01);AMPK和p-AMPK表达减少(P均<0.01),AMPK的下游因子ULK1及p-ULK1表达均减少(P均<0.01)。结论鱼藤酮可促进RTAEC发生自噬,而其自噬机制可能是通过AMPK-ULK1信号通路介导。

田蓟苷调节AMPK/SIRT1/PGC1α信号通路对脑出血大鼠认知功能和神经元损伤的影响

目的:探讨田蓟苷(TIL)对脑出血(ICH)大鼠认知功能、神经元损伤及腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/沉默调节蛋白1(SIRT1)/过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC1α)信号通路的影响。方法:采用Ⅳ型胶原酶注射法构建ICH大鼠模型,将造模成功的ICH大鼠随机分为模型组(ICH组)、TIL组(16 mg/kg)、AMPK抑制剂组(Compound C组,250μg/kg)、TIL+AMPK抑制剂组(TIL+Compound C组),另设假手术组(Sham组),每组12只。采用改良的Garcia JH法、Morris水迷宫实验和敞箱实验评价大鼠的神经功能和认知功能;苏木素-伊红(HE)和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法行脑组织病理学和神经元凋亡观察;蛋白质印迹法(Western Blot)检测AMPK/SIRT1/PGC1α通路蛋白表达。结果:与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织出现细胞核皱缩、排列紊乱等损伤,神经功能评分、穿越平台次数、垂直活动得分和水平活动得分、磷酸化AMPK(p-AMPK)/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白水平均明显下降(P<0.05),找寻平台时间、神经元凋亡率、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达水平均明显增加(P<0.05);与ICH组相比,TIL组大鼠脑组织损伤减轻,神经功能评分、穿越平台次数、垂直活动得分和水平活动得分、p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC1α蛋白水平均明显增加(P<0.05),找寻平台时间、神经元凋亡率、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);而Compound C组大鼠以上指标呈现相反的趋势。且TIL对ICH大鼠脑组织及认知功能的保护作用均被AMPK抑制剂Compound C减弱(P<0.05)。结论:TIL可能通过激活AMPK/SIRT1/PGC1α通路,改善ICH大鼠认知功能,减轻神经元损伤。

花黄色素调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对冠心病大鼠心肌损伤的影响

目的:探讨花黄色素(SY)调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/核转录因子-κB(NF-κB)对冠心病(CHD)大鼠心肌损伤的影响。方法:将60只SD大鼠随机分为正常对照组(NC组,生理盐水)、模型组(Model组,生理盐水)、SY组(100 mg/kg SY)、EX-527组(47 mg/kg EX-527)、SY+EX-527组(100 mg/kg SY+47 mg/kg EX-527),每组12只,持续4周给予相应药物。试剂盒检测血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平和心肌白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;苏木素-伊红(HE)染色法进行心肌组织病理学观察;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织AMPK/SIRT1/NF-κB通路相关蛋白表达。结果:与NC组相比,Model组大鼠心肌细胞数量少且排列杂乱,细胞核皱缩,TC、TG、LDL-C、氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显上升(P<0.05),SOD、GSH-Px水平及磷酸化-AMPK(p-AMPK)/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降(P<0.05)。与Model组比较,SY组大鼠心肌细胞数量增多且排列整齐有序,TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显下降(P<0.05),SOD、GSH-Px水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显上升(P<0.05);而EX-527组以上指标呈现相反趋势。与SY组相比,SY+EX-527组大鼠心肌损伤加重,TC、TG、LDL-C、ox-LDL、IL-6、TNF-α水平、心肌细胞凋亡率及NF-κB蛋白水平明显上升(P<0.05),SOD、GSH-Px水平及p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白水平明显下降(P<0.05)。结论:SY可能通过调控AMPK/SIRT1/NF-κB通路降低氧化应激,减轻炎症反应,对冠心病大鼠心肌损伤起到一定改善作用。

白藜芦醇通过SIRT1/AMPK信号通路减轻MPTP诱导的小鼠多巴胺能神经元丢失

目的观察白藜芦醇(RV)对帕金森病(PD)小鼠的神经保护作用,并探索其发挥神经保护作用的可能机制。方法将48只小鼠随机分为CON组、MPTP组、RV+MPTP组和EX527+RV+MPTP组,每组12只。腹腔注射MPTP建立PD小鼠模型,并给予RV灌胃、SIRT1特异性抑制剂EX257腹腔注射处理,利用免疫荧光、western blot等检测相关蛋白表达。结果给予RV后,与MPTP组相比,RV+MPTP组SIRT1蛋白表达显著增加(P<0.001),p-AMPK蛋白水平显著升高(P<0.01),Cleaved caspase 3蛋白水平显著下降(P<0.01),小鼠黑质区TH阳性神经元丢失率明显降低,纹状体组织中TH蛋白表达显著增加(P<0.01)。给予EX527后,阻断了RV的上述作用,p-AMPK蛋白水平显著降低(P<0.01),Cleaved caspase 3显著升高(P<0.01),小鼠黑质区TH阳性神经元丢失率明显升高,纹状体组织中TH蛋白表达显著下降(P<0.001)。结论 RV可能通过激活SIRT1/AMPK信号通路,SIRT1与AMPK相互调控,减少MPTP小鼠黑质区多巴胺能神经元丢失。

蜜环菌多糖对大鼠INS-1细胞凋亡的拮抗作用

培养大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1),以四氧嘧啶损伤细胞,培养液中加入不同浓度的AMP-1,MTT法测定细胞存活率,PI荧光染色观测凋亡细胞密度,流式细胞术法检测细胞凋亡率,Western blot法检测蛋白bcl-2和bax的表达。结果表明,AMP-1浓度在50 mg·L^(-1)至500 mg·L^(-1)之间,均可提高受四氧嘧啶损伤的INS-1细胞的存活率,其中浓度为400 mg·L^(-1)时存活率最高;凋亡细胞密度,随AMP-1浓度的增大而降低;AXN+AMP-1组INS-1细胞凋亡率均低于四氧嘧啶组;Western blot法检测显示bcl-2蛋白表达量升高,bax蛋白表达量降低。AMP-1对四氧嘧啶诱导大鼠INS-1细胞凋亡具有明显的拮抗作用,其作用机制可能是通过对线粒体途径中bcl-2和bax蛋白表达的调控而抑制了细胞的凋亡。

家兔发热诱导热休克转录因子1聚合对体温及下丘脑cAMP含量的影响

目的:观察热休克转录因子1(HSF1)聚合对家兔脂多糖(LPS)诱发性发热反应的影响,并研究其与下丘脑cAMP含量变化的关系,以探讨HSF1是否参与热限作用及可能的机制。方法:家兔随机分成4组:(1)对照组(N):注射无水乙醇;(2)槲皮素组(Q):注射槲皮素-无水乙醇溶液(2.5/μmol/L);(3)LPS组(L):注射无水乙醇,10min后静脉注射脂多糖(LPS,0.5μg/kg);(4)槲皮素+LPS组(Q+L):注射槲皮素-无水乙醇溶液(2.5μmol/L),10min后静脉注射LPS(剂量同L组)。通过复制LPS性发热家兔模型诱导HSF1聚合,观察聚合的HSF1对LPS性发热效应的影响,并用放射免疫法检测下丘脑中cAMP含量的变化。结果:Q+L组与L组比较,在240～360min期间即时体温与基础体温之差(△T)差异显著(P<0.05),6h体温反应指数(TRI6)为8.32±0.63,明显高于L组(P<0.01)。Q+L组各时间点的cAMP含量与L组相比明显增加(P<0.01)。HSF1三聚体的表达从致热后60min开始逐渐增多,达到体温最高值时(180min)为对照水平的1.77倍,此后,随着HSF1三聚体表达水平的进一步升高,体温逐渐下降。而预先使用槲皮素抑制HSF1的聚合,Q+L组的HSF1三聚体的表达量在60、180、240、360min组均低于对应的L组(P<0.05),HSP70表达水平相应降低;cAMP含量增多,发热幅度升高,发热时程延长。结论:聚合的HSF1对LPS性发热有抑制效应,此作用可能与抑制下丘脑cAMP的生成有关。

HSF1基因缺失通过上调microRNA-195a-3p加速压力超负荷下心脏重构

目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)调控微小RNA-195a-3p (miR-195a-3p)对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响,旨在阐明HSF1基因缺失加重压力超负荷下心脏重构的病理分子机制。方法:压力超负荷动物模型采用小鼠主动脉弓缩窄(TAC),辅以心脏超声功能评价。在体实验分组为HSF1基因敲除(HSF1^(-/-))小鼠假手术组、C57BL/6野生型(WT)小鼠假手术组、HSF1^(-/-)小鼠TAC模型组和C57BL/6 WT小鼠TAC组;细胞实验分组为对照组、miR-195a-3p模拟物干预组和阴性对照microRNA(miR-NC)干预组。TAC术后4周,通过病理组织切片检测各组小鼠心肌肥厚(HE染色)和血管新生(CD31染色),小鼠心超检查心脏主要功能指标变化;通过生物信息软件TargetScan 6.2结合萤光素酶(luciferase)报告基因检测,以及Western blot验证,测定miR-195a-3p调控血管新生的下游分子靶点;并用miR-195a-3p诱导微血管内皮细胞,观察其对细胞成管能力的影响。结果:HSF1缺失会导致TAC诱导的小鼠左心室重构加重。芯片筛查结果表明HSF1缺失可促进心脏12种microRNAs表达上调,5种microRNAs在心肌微血管内皮细胞中表达显著升高,其中miR-195a-3p的增高具有统计学显著性。miR-195a-3p过表达可以有效抑制微血管内皮细胞CD31和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,阻滞细胞形成管腔样结构。TargetScan 6.2预测miR-195a-3p的靶点为AMP活化蛋白激酶α2(AMPKα2),在微血管内皮细胞用miR-195a-3p模拟物干预可以有效抑制AMPKα2的表达,同时miR-195a-3p模拟物也抑制了CD31和VEGF的表达。结论:HSF1基因缺失导致的miR-195a-3p表达上调是加速压力超负荷下心脏重构的重要诱因,其机制可能是通过抑制AMPKα2介导的血管新生信号通路的激活。

去乙酰化酶SIRT1过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK活性的影响

构建猪SIRT1基因全长编码区(coding region sequence,CDS)的真核表达载体,转染猪原代卵巢颗粒细胞,探讨SIRT1基因过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK基因的转录及其蛋白活性的影响。测序结果表明,猪SIRT1基因的CDS区全长大小为2 229 bp,与NCBI发布的猪SIRT1基因m RNA序列(EU030283.2)一致;转染p EGFP–C1–SIRT1载体的颗粒细胞中SIRT1的m RNA表达水平和蛋白表达水平极显著高于空载体对照组(P<0.01);p EGFP–C1–SIRT1转染组细胞中,AMPK–α1和AMPK–α2基因的m RNA表达量显著高于空载体对照组,且细胞中AMPKαThr172位点的磷酸化水平显著升高(P<0.05)。结果表明,体外培养的原代猪卵巢颗粒细胞中的SIRT1基因过表达使AMPK的表达显著增加,影响AMPK的活性,推测SIRT1可能通过AMPK在猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用。

肉鸭PRKAA1和PRKAA2基因表达水平及其与剩余采食量性状的相关性分析

[目的]本试验旨在探讨AMP激活蛋白激酶α1和α2基因(PRKAA1、PRKAA2)在高、低饲料效率组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中表达水平及其与剩余采食量(RFI)性状的相关性。[方法]选取体质量相近的H系肉公鸭1 000只,测定21~42日龄时的采食量和体增重,计算RFI。挑选高、低RFI组肉鸭各8只,采用定量PCR检测PRKAA1和PRKAA2在2组肉鸭胸大肌、腿肌和肝脏中表达水平。[结果]PRKAA1 mRNA在低RFI组肉鸭胸大肌中表达量极显著高于高RFI组(P<0.01),腿肌中表达量显著高于高RFI组(P<0.05)。低RFI组胸大肌和腿肌中PRKAA2 mRNA表达量显著高于高RFI组(P<0.05)。相关性分析表明,肉鸭胸大肌中PRKAA1 mRNA相对表达量与日采食量、饲料转化率和RFI显著负相关(P<0.05),腿肌中相对表达量与日采食量和RFI显著负相关(P<0.05)。另外,胸大肌中PRKAA2 mRNA相对表达量与日采食量和RFI显著负相关(P<0.05),腿肌中相对表达量与RFI呈显著负相关关系(P<0.05)。[结论]PRKAA1和PRKAA2基因在高、低RFI组肉鸭胸大肌和腿肌中表达量存在显著差异且与剩余采食量性状显著相关。

ERα-AMPK-Sirt1信号通路在骨质疏松症中的作用

近年来,与骨代谢相关的分子信号通路成为研究的热点。其中Wnt /β-catenin 信号通路、RANKL/RANK/OPG 信号通路、NF-κB 信号通路、PPAR-γ信号通路、PTH 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、Hedgehog 信号通路和Notch 信号通路对骨质疏松症的发病具有重要意义,但目前尚未有关于ERα-AMPK-Sirt1 信号通路的研究报道。雌激素受体α( ERα)通过与配体结合、单磷酸腺苷活化蛋白激酶( AMPK)通过磷酸化作用、沉默信息调节因子2 相关酶1( Sirt1)通过去乙酰化修饰等共同调控成骨细胞、破骨细胞的功能,且三者之间存在一定的上下游关系;研究表明ERα能够直接增加LKB1 启动子的活性,而LKB1 是AMPK 最主要的上游蛋白激酶,活化的LKB1 能够激活AMPK;AMPK 可以激活Sirt1,而Sirt1 反过来又可以通过磷酸化作用来激活AMPK,二者之间相互作用可参与调控成骨细胞的自噬或凋亡等,以上均提示了ERα-AMPK-Sirt1 信号通路在骨质疏松症发病机制中的重要作用,因此有必要对ERα-AMPK-Sirt1 信号通路进行深入研究,以便更好地指导临床抗骨质疏松新药物的研发,为临床实践提供更多可靠的循证医学证据。

乳腺癌中的脂联素受体1表达及其信号通路激活对癌细胞的作用机制研究

目的探讨人能量代谢相关基因脂联素受体1(AdipoR1)在乳腺癌中的表达及其信号通路激活对乳腺癌细胞的作用机制。方法采用已发表的基因表达数据库数据,分析AdipoR1在各病理亚型中的不同表达,以及AdipoR1基因表达与HER-2表达的相关性。采用免疫印迹法(Western blotting)检测AdipoR1在MCF-7、MDA-MB-231和SKBR3等ER+、HER-2+及ER-癌细胞株中的表达;采用Western blotting法检测MCF-7细胞在脂联素不同时间长度的作用下,细胞内信号蛋白AMPK及S6激酶(S6K)的活化。结果 AdipoR1在正常乳腺组织样乳癌中基因表达最低,与其他各组病理亚型乳癌有显著性差异(P<0.05)。在乳腺癌中,AdipoR1基因表达与HER-2基因呈正相关(Pearson,r=0.134)。AdipoR1广泛表达于ER+、HER-2+及ER-乳腺癌细胞系中。在低浓度(0.5μg/ml)脂联素作用下,AMPK及mTOR的底物蛋白S6K在15min发生磷酸化活化,磷酸化信号随着时间延长而加强,30min时信号强度达到最高峰;之后开始下降,但在1h仍能检测到磷酸化。结论 AdipoR1基因表达水平在各乳腺癌病理亚型不同,该受体在各类乳腺癌细胞株中广泛表达。乳腺癌中的脂联素信号通路激活,可活化AMPK及mTOR信号通路,从而影响肿瘤细胞的能量代谢、蛋白合成及细胞增殖过程。

miR-122靶向调控CREB1对膀胱癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其分子机制

目的观察微小RNA122(miR-122)通过靶向调控环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响,并探讨其可能的作用通路。方法TargetScan7.1软件预测程序显示,miR-122与CREB1启动子区存在连续的结合位点,双荧光素酶基因报告实验结果显示,在膀胱癌J82细胞中miR-122可靶向负调控CREB1。将J82细胞分为三组,共转染组采用Lipofectamine TM 2000转染miR-122 mimic及CREB1过表达质粒,miR-122 mimic组转染miR-122 mimic,对照组转染对照质粒,转染48 h。采用MTS法和平板克隆实验检测细胞增殖能力(分别以增殖OD值和克隆形成数表示),Transwell小室实验检测细胞侵袭能力(以穿膜细胞数表示),Western blotting法检测细胞CREB1及蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达。结果与对照组比较,miR-122 mimic组和共转染组细胞增殖OD值、克隆形成数、穿膜细胞数均降低,且miR-122 mimic组降低更明显(P均<0.05)。与对照组比较,miR-122 mimic组和共转染组细胞CREB1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达降低,且miR-122 mimic组降低更明显(P均<0.05)。与对照组比较,miR-122 mimic组和共转染组细胞Akt、mTOR表达均无明显变化(P均>0.05)。结论miR-122通过作用靶点CREB1负向调控Akt/mTOR通路,从而抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭。

AMPK信号通路在ECG诱导人鼻咽癌细胞株C666-1凋亡中的作用研究

目的研究AMPK信号通路在ECG诱导人鼻咽癌细胞株C666-1凋亡中的作用。方法人鼻咽癌C666-1细胞给予AMPK特异性抑制剂compound C或不同浓度ECG处理后,分别采用CCK-8法和TUNEL染色法检测细胞增殖情况和凋亡;采用Western blotting法检测AMPK、p70S6K、S6等相关蛋白磷酸化水平。结果 ECG可剂量依赖性地增加C666-1细胞中AMPK的磷酸化水平并抑制p70S6K和S6的磷酸化;给予compound C预处理之后可显著逆转ECG对C666-1细胞增殖和凋亡的影响,并逆转ECG对AMPK、p70S6K和S6等磷酸化水平的影响。结论ECG通过调控AMPK依赖的通路抑制人鼻咽癌细胞株C666-1增殖,并诱导其凋亡。

汉黄芩素调节AMPK/SIRT1信号通路对骨质疏松大鼠骨折愈合的影响

目的 探究汉黄芩素(WOG)调节腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)信号通路对骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨折愈合的影响。方法 将60只SPF级SD雌性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、骨质疏松性骨折(OPF)模型组(Model组)、低剂量WOG组(WOG-L组,50mg/kg)、高剂量WOG组(WOG-H组,100 mg/kg)和高剂量WOG+AMPK抑制剂Compound C组(WOG-H+CC组,100 mg/kg WOG+0.2 mg/kg Compound C),每组12只。Model组、WOG-L组、WOG-H组、WOG-H+CC组采用双侧卵巢切除术与右侧股骨干骨折髓内固定术构建骨质疏松性骨折(OPF)大鼠模型。放射性检查评估骨折愈合情况。采用双能X线骨密度扫描仪检测大鼠股骨痂骨密度(BMD)。通过三点弯曲实验和压缩实验对大鼠股骨骨生物力学进行检测。比色法检测大鼠血清骨钙素(OC)、I型前胶原羧基端肽(PICP)水平。HE染色观察骨折处骨痂的病理学变化。Western blot法检测股骨组织中AMPK/SIRT1信号通路相关蛋白表达。结果 与Sham组相比,Model组大鼠骨折愈合评分、股骨上、下端骨痂BMD、骨痂最大位移、最大应力和最大负荷、血清OC、PICP水平、股骨组织中AMPK磷酸化水平、SIRT1蛋白表达显著降低(P <0.05),骨折端未见骨痂生长,骨折线清晰,骨小梁较细,数量减少,间隙增大,结构紊乱疏松。与Model组相比,WOG-H组大鼠骨折愈合评分、股骨上、下端骨痂BMD、骨痂最大位移、最大应力和最大负荷、血清OC、PICP水平、股骨组织中AMPK磷酸化水平、SIRT1蛋白表达显著升高(P <0.05),有连续性骨痂包绕贯穿于骨折端,髓腔再通,骨折线模糊不清,骨小梁形态较完整。Compound C减弱了WOG对OPF大鼠骨折愈合的促进作用。结论 WOG可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路促进OPF大鼠的骨折愈合。

血管紧张素-(1-7)通过AC-cAMP途径增加THP-1源性泡沫细胞ABCA1的表达并减少细胞胆固醇含量

目的:构建THP-1源性泡沫细胞模型,探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]和腺苷酸环化酶抑制剂MDL对THP-1源性泡沫细胞胆固醇逆转运相关蛋白——ATP结合盒转运子A1(ABCA1)表达和胆固醇含量的影响。方法:将THP-1源性单核细胞诱导为巨噬细胞,加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立泡沫细胞模型。实验分为4组:正常泡沫细胞组、MDL组、Ang-(1-7)组和MDL+Ang-(1-7)组。处理24 h后,分别通过ELISA法、荧光定量PCR法和Western blotting检测各组细胞cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量,闪烁计数法检测各组细胞胆固醇流出率,高效液相色谱法检测各组细胞胆固醇含量。结果:(1)Ang-(1-7)组cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量较泡沫细胞组有明显升高(P<0.05),胆固醇流出率较泡沫细胞组明显增高(P<0.05),胆固醇含量较泡沫细胞组显著降低(P<0.05)。(2)MDL组cAMP表达水平、ABCA1 mRNA相对表达量和蛋白含量较泡沫细胞组有明显降低(P<0.05),胆固醇流出率较泡沫细胞组明显降低(P<0.05),胆固醇含量较泡沫细胞组增高(P<0.05)。(3)MDL+Ang-(1-7)组数值介于Ang-(1-7)组与泡沫细胞组之间。结论:(1)Ang-(1-7)能促进泡沫细胞ABCA1的表达增加,促进胆固醇外流,减少泡沫细胞胆固醇含量,逆转泡沫细胞的形成。(2)MDL可以抑制腺苷酸环化酶的活性,减少cAMP的生成,从而部分拮抗Ang-(1-7)的上述作用,但不能完全阻断Ang-(1-7)的作用。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用

目的进一步证实在猪主动脉平滑肌细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)刺激引起的细胞增生,以及探讨其可能的机制。方法使用AMPK活化剂二甲双胍增强细胞内AMPK的活化(表现为AMPK第172位苏氨酸磷酸化增高);采用定点突变获得组成性激活型AMPK突变体,设计短发卡RNA (short hairpin,shRNA)序列构建AMPK干扰载体,并分别包装产生组成性激活型AMPK和AMPK敲低慢病毒。分别采用AMPK活化剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染和AMPK敲低慢病毒感染猪主动脉平滑肌细胞,观察AMPK活性对猪主动脉平滑肌细胞中IGF-1刺激引起的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)活性(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化)及其下游细胞增生的影响。结果二甲双胍明显增强AMPK的活性(表现为172位苏氨酸磷酸化增高),并明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化(表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化受到抑制);组成性激活型AMPK表达能明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化以及下游的细胞增生;在AMPK敲低细胞中,IGF-1能引起更强的ERK1/2活化。结论 AMPK能通过抑制ERK1/2活化抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号,并能抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生。

葛根素对脑梗死大鼠p-AMPK、Egr-1水平的影响

目的研究葛根素对脑梗死大鼠梗死周围脑组织磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、早期生长反应因子-1(Egr-1)蛋白水平的影响,探讨葛根素保护作用的分子机制。方法42只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、对照组和葛根素组,每组14只。线栓法建立右侧永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。假手术组仅分离劲动脉。葛根素组于MCAO术后立即予葛根素(100 mg/kg,溶于10%乙醇)腹腔注射,对照组予等体积溶剂(10%乙醇)腹腔注射。术后24 h,采用改良的Longa评分法来评价神经功能;TTC染色显示脑梗死体积;采用western blot来观察3组p-AMPK、AMPK、Egr-1蛋白水平的变化。结果与对照组比较,葛根素组大鼠神经功能明显改善,脑梗死体积显著减小(P<0.05)。与假手术组比较,对照组大鼠脑组织Egr-1蛋白表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);而与对照组比较,葛根素组p-AMPK水平以及p-AMPK/AMPK比值明显上调,Egr-1蛋白水平有显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。3组大鼠AMPK蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论葛根素通过下调过高表达的Egr-1水平、上调p-AMPK蛋白表达和p-AMPK/AMPK比值,抑制过度的炎性反应,且能够显著改善了MCAO术后神经功能,减小了脑梗死体积。通过激活AMPK抑制炎性反应,是葛根素对大鼠脑梗死脑保护作用的分子机制。

番茄红素调节AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路对过敏性结膜炎小鼠的治疗作用

目的基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子1(SIRT1)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路探讨番茄红素(LYC)减轻过敏性结膜炎小鼠炎症的作用机制。方法利用卵清蛋白(OVA)致敏建立AC小鼠模型。将BALB/c小鼠分为正常组(NC组)、模型组(AC组)、LYC低组(5 mg/kg)、LYC中组(10 mg/kg)、LYC高组(20 mg/kg),LYC高+AMPK抑制剂(CC)组(0.2 mg/kg)。观察小鼠眼周情况,采用苏木精-伊红染色观察结膜组织病理学变化,采用流式细胞仪检测脾脏中Th17、Treg细胞比例,采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测血清中炎症因子、免疫球蛋白(Ig)E、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)水平,采用蛋白质印迹法检测结膜组织AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路蛋白水平。结果与NC组比较,AC组小鼠眼部出现结膜充血、红肿、溢泪等现象,结膜组织嗜酸性粒细胞较多,Th17细胞比例、白细胞介素(IL)-17、IL-6、IgE、TSLP、磷酸化AMPK(p-AMPK)、核NF-κB p65水平升高,Treg细胞比例、IL-10、转化生长因子(TGF)-β、SIRT1水平降低(P<0.05)。与AC组比较,LYC中、高组小鼠眼部结膜充血、水肿、溢泪等明显减轻,结膜组织嗜酸性粒细胞较少,脾脏中Th17/Treg细胞比例趋向平衡,IL-17、IL-6、IgE、TSLP、核NF-κB p65水平降低,IL-10、TGF-β、p-AMPK、SIRT1水平升高(P<0.05)。CC可抵消LYC对AC小鼠的上述保护作用。结论LYC可减轻AC小鼠的过敏和炎症反应,维护机体免疫平衡,其机制可能与促进AMPK/SIRT1通路活化,抑制NF-κB通路活化有关。