基于短链抗菌肽Cn-AMP1的拼接肽合成及抗菌活性研究

目的以短链抗菌肽Cn-AMP1为基础拼接得到的抗菌肽C2和C4的抗菌活性和抗菌机制研究。方法应用生物信息学方法分析多肽的理化性质参数;使用圆二色光谱法测定其二级结构;使用CCK-8法测定其对BEAS-2B细胞毒性;通过抑菌实验和细菌细胞外膜实验,研究Cn-AMP1、C2、C4肽靶向细菌细胞膜的作用机制。结果圆二色光谱测定结果表明,在模拟膜环境中设计合成的C2和C4为α-螺旋结构;抗菌肽C2和C4相较于母肽Cn-AMP1具有良好的抗菌活性以及较低的细胞毒性;此外抗菌肽C2和C4与母肽Cn-AMP1相比都具有个更强的破坏细胞膜能力。结论C2和C4肽具有比Cn-AMP1肽更好的抗菌活性。

拟南芥AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应

高盐胁迫严重影响植物的生长发育及农作物产量,因此鉴定盐胁迫响应相关基因至关重要。拟南芥的AMP1编码一个推测的谷氨酸羧肽酶,参与植物的生长发育、光形态建成与种子休眠。研究证明了AMP1的一个新功能,它的缺失提高了缺失突变体amp1的抗高盐胁迫的能力,研究证明amp1突变体的强抗高盐胁迫表型一方面是由于在高盐胁迫下amp1突变体比野生型中积累了更多的甜菜碱和脯氨酸降低了突变体细胞的水势,另一方面高盐胁迫条件下amp1突变体中高盐胁迫响应的下游基因RD29A,以及AHA3的表达量也高于野生型,后者可促进Na+的外排;高盐条件能够对植物造成氧化胁迫,研究发现AMP1的缺失还上调了抗氧化相关基因ZAT10/12的表达量,进而降低了在高盐胁迫条件下amp1突变体内过氧化物的积累水平,减轻对细胞的损伤和生长的抑制,这些都提高了amp1突变体的抗高盐胁迫的能力。以上结果证明在拟南芥中AMP1负调控植物对高盐胁迫的反应过程。

敲除AMP1基因可提高干旱响应基因的表达量从而增强拟南芥的抗旱能力

干旱严重影响植物的生长发育及农作物产量,因此研究植物的干旱反应机制显得至关重要.我们发现在拟南芥中一个推测的谷氨酸羧肽酶,AMP1,其缺失突变体amp1的抗旱能力大大增强.基因芯片分析表明,amp1突变体抗旱能力的提高与许多干旱响应基因的高表达息息相关,例如,在amp1突变体中2个干旱诱导表达的转录因子基因,DREB2A和DREB1A的表达量升高;AT1G61340(LEA蛋白)的表达量也升高了很多,它在干旱条件下具有解毒和缓解细胞伤害的作用.而且,在amp1突变体中DREB2A转录因子的2个下游基因RD29A和COR47受干旱诱导的表达量和时间都比野生型中高和早.在突变体中一些参与蛋白代谢、糖代谢和脂代谢的基因上调,一些保护和解毒相关基因表达量也升高,这些都可以给突变体在抗旱反应过程提供一定的保护作用.因此,我们认为AMP1基因在干旱胁迫反应中对干旱响应基因的表达起到一个负调控作用.实验中我们还发现,amp1突变体具有较低的水势与非常发达的根系,这也可能在抗旱反应中起到了一定作用.

Ace-AMP1过表达毕赤酵母工程菌株的构建及其对梨青霉病的抑制作用

为解决从洋葱种子中直接提取Ace-AMP1抗菌肽难度大、成本高、提取率低的问题,本研究根据毕赤酵母密码子的偏好性,优化合成了洋葱种子的Ace-AMP1抗菌肽基因,将其连接到表达载体pPICZαA中,并电转化毕赤酵母GS115感受态细胞进行表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)及蛋白质印迹法(Western-blotting)结果证实,Ace-AMP1过表达GS115构建成功,抗菌肽能在酵母体内稳定表达。对蛋白质表达水平的检测结果表明,GS115/Ace-AMP1经诱导后上清液中蛋白质质量浓度显著增加,并于84 h达到最大值(109μg/mL),而对照组则一直处于较低水平。对梨果实青霉病的抑制效果实验表明:GS115/Ace-AMP1能显著抑制扩展青霉(Penicillium expansum)在梨果实上的侵染;与对照组相比,青霉病发病率下降34%,平均病斑直径减小65%。本研究为Ace-AMP1抗菌肽的大规模生产及其抑制果实采后病害的开发利用奠定了基础。

拟南芥AMP1基因RNAi表达载体的构建及转基因株系的抗旱性分析

利用Gateway克隆技术构建AMP1基因的RNAi表达载体p K7GWIWG2-AMP1转化拟南芥,获得AMP1下调表达的转基因株系,以拟南芥野生型为对照,研究AMP1基因在干旱胁迫中的作用。结果表明,甘露醇模拟干旱能提高RNAi株系的萌发率,增加相对根长,表现出了一定的干旱耐受性;丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)的测定结果可以看出,与野生型相比,RNAi株系的MDA含量降低,Pro含量升高和POD、SOD酶活性增强;外源ABA可抑制RNAi株系种子萌发,减小叶片气孔开度。另外,Real-time PCR分析表明,正常条件下RNAi株系中AREB1基因表达上调。可见通过下调AMP1基因表达,可以提高转基因拟南芥株系抗干旱胁迫能力。

多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种好发于青春期及育龄期女性的涉及诸多因素的内分泌代谢性疾病,临床主要表现为闭经、体胖、多毛痤疮以及妊娠率显著降低,但目前其病因病机尚不清楚。胰岛素抵抗(IR)与多种慢性非传染性疾病(高血压、糖尿病、心脑血管疾病、PCOS等)相关,目前已知磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、肝激酶B1/AMP活化的蛋白激酶、沉默信息调节因子1/叉头框转录因子O1、Toll样因子4/核因子κB信号通路参与了PCOS伴IR(PCOS-IR)的作用机制,因此充分认识PCOS-IR的发病机制在疾病预防中有重要临床意义。

针刺调控AMPK/Sirt1通路对肥胖大鼠胃肠动力、脂联素的影响

目的探究针刺调控AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/沉默信息调节因子(Sirt)1通路对肥胖大鼠胃肠动力、脂联素(APN)的影响。方法选取SPF级SD雄性大鼠39只,空白组、模型组、药物对照组、针刺组各9只。空白组、模型组只进行生理盐水灌胃,不做其他任何处理,药物对照组给予2 ml二甲双胍溶液灌胃,针刺组给予一次性无菌针刺治疗。检测附睾脂肪组织细胞面积、血脂指标水平、胃肠动力、APN水平及AMPK/Sirt1信号通路表达情况。结果与空白组相比,其余3组脂肪细胞平均面积及三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平、胃排空率均明显升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平、小肠推进率、APN水平、AMPK、Sirt1表达量均明显降低(均P<0.05);与模型组相比,药物对照组、针刺组脂肪细胞平均面积及TG、TC、LDL-C水平、胃排空率均明显降低,HDL-C水平、小肠推进率、APN水平、AMPK、Sirt1表达量均明显升高(均P<0.05);与药物对照组相比,针刺组脂肪细胞平均面积、TG、TC、LDL-C水平、胃排空率均明显降低,HDL-C水平、小肠推进率、APN水平、AMPK、Sirt1表达量均明显升高(均P<0.05)。结论通过针刺对肥胖大鼠进行治疗干预,缩小脂肪细胞平均面积,改善血脂功能和肠胃动力紊乱情况,提高APN水平,调控AMPK/Sirt1通路,改善肥胖症状。

大黄酸通过Sirt1/AMPK信号通路对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝功能及肝细胞脂代谢的影响

目的:研究不同浓度大黄酸灌胃通过沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)/amp活化蛋白激酶(AMPK)信号通路对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠的肝功能及肝细胞脂代谢的影响。方法:实验小鼠分为空白组,模型组,低、高剂量大黄酸组和高剂量大黄酸+Sirt1抑制剂(高剂量大黄酸+EX527)组。动物实验:除空白组外其余各组小鼠采用连续饲喂高脂饲料(8周)构建NAFLD小鼠模型。8周干预完成后各组小鼠于处死前称重并记录,全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、游离脂肪酸(NEFA)水平;ELISA法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肝脏组织乙酰辅酶羧化酶(ACC)水平;苏木精伊红染色(HE)及油红O染色检验肝组织硬化程度及细胞脂肪病变水平。细胞实验:采用200μmol/L棕榈酸(PA)处理AML-12细胞24 h构建NAFLD细胞模型。全自动生化分析仪检测TG含量;油红O染色观察AML-12细胞脂质积累情况;Western Blot法检测肝脏组织和AML-12细胞中Sirt1、AMPKα、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)蛋白表达。结果:与空白组相比,模型组小鼠体重和肝脏湿重升高,肝脏组织明显损伤,AML-12细胞中TG含量及小鼠血清TG、TC、MDA、ALT、AST、NEFA水平显著升高,肝脏组织ACC含量降低(P<0.05),肝脏组织和AML-12细胞中Sirt1、p-AMPKα/AMPKα表达降低,脂肪病变严重,脂质积累增高(P<0.05)。与模型组相比,低、高剂量大黄酸组小鼠体重和肝脏湿重降低,肝脏组织损伤减轻,AML-12细胞中TG含量及小鼠血清TG、TC、MDA、ALT、AST、NEFA水平显著降低,肝脏组织ACC含量升高(P<0.05),肝脏组织和AML-12细胞中Sirt1、p-AMPKα/AMPKα表达升高,脂肪病变减轻,脂质积累降低(P<0.05)。与高剂量大黄酸组相比,高剂量大黄酸+EX527组各项指标均有所逆转(P<0.05)。结论:大黄酸可有效通过调节小鼠肝细胞脂代谢改善NAFLD小鼠肝功能水平,其机制可能与激活Sirt1/AMPK信号通路有关。

位阻胺混合甘氨酸盐溶液吸收CO_2的研究

在双搅拌反应釜中研究了位阻胺2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)与甘氨酸钠(SG)混合溶液吸收CO2的性能.实验温度293～313K,混合溶液的浓度为AMP(1.5kmol/m3)+SG(0.2,0.4,0.6,0.8kmol/m3),SG浓度每增加0.2kmol/m3,200min内的平均吸收速率分别提高11.47%,10.07%,9.18%和5.33%.与AMP单一溶液相比,混合溶液在200 min时的吸收容量增加了11.5%～41.1%.在293～313K,吸收速率随温度上升而提高.使用加热的方法进行再生实验,得到1.5 kmol/m3 AMP+0.6 kmol/m3 SG混合液的最适再生温度为378K.AMP+SG混合溶液的再生效率高于单一SG溶液及AMP+MEA/DEA混合溶液.

藏药珊瑚七十味丸对高脂血症模型大鼠的降脂作用及机制研究

目的研究藏药珊瑚七十味丸对高脂血症(HLP)模型大鼠的降脂作用,并初步探讨其作用机制。方法将60只SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组(阳性对照,20 mg/kg)和珊瑚七十味丸低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg),每组10只。正常组大鼠饲喂常规饲料,其余各组大鼠饲喂高脂饲料建立HLP模型,连续喂养4周。各给药组大鼠在造模同时即开始灌胃相应药物,正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续4周。末次灌胃后,检测各组大鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,观察各组大鼠肝组织病理变化,测定各组大鼠肝组织中AMP活化蛋白激酶1(AMPK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、肝激酶B1(LKB1)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)蛋白的表达情况。结果低、中、高剂量珊瑚七十味丸均可显著降低HLP模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平以及肝组织中HMGCR蛋白表达水平(P<0.05),显著升高HLP模型大鼠血清中HDL-C水平及肝组织中AMPK磷酸化水平、LKB1蛋白表达水平(P<0.05),不同程度地改善HLP模型大鼠肝组织的病理变化。结论珊瑚七十味丸能降低HLP模型大鼠的血脂水平;其机制可能与抑制LKB1/AMPK信号通路的传导,从而调节脂代谢相关。

MDEA复合溶液吸收CO_2反应热实验研究

采用自主设计的中压搅拌反应釜及反应热测试装置,以CO_2和CH_4体积比为1∶1的混合气体作为模拟原料气,N-甲基二乙醇胺(MDEA)为主吸收剂,分别添加单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、哌嗪(PZ)和2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)作为活化剂,通过反应热对比分析,优选了最佳的MDEA二元复合溶液。得出各体系最佳配比分别为:32%MDEA+3%MEA、30%MDEA+5%DEA、32%MDEA+3%PZ、30%MDEA+5%AMP。其中,32%MDEA+3%PZ是最佳的二元复合溶液,反应热为67.330 kJ·mol^(-1)CO_2。

肝豆汤通过肝激酶B1/AMP活化蛋白激酶途径改善高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性

目的研究肝豆汤对高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性的影响及可能的机制。方法采用60只C57BL/6雄性小鼠,按随机数字表法分为六组:正常饮食组,模型组,东宝肝泰组,肝豆汤低、中、高剂量组,每组10只。除正常饮食组外,其余各组均给予高脂饲料造模,同时分别灌胃给予生理盐水,东宝肝泰冲剂0.225 g/kg,肝豆汤(22,44,66 g/kg)各2 mL·kg^(-1)·d^(-1),药物干预6周后,禁食24 h,采用苏木精-伊红(HE)和油红O染色观察各组小鼠肝组织病理变化及肝脏脂滴数量,采用试剂盒测定各组小鼠肝组织总胆固醇、三酰甘油的含量及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性,采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测小鼠肝脏3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、尼曼匹克C1型类似蛋白(NPC1L1)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)及磷酸化肝激酶B1(p-LKB1)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)相对表达情况。结果与正常组[(12.78±1.17)IU/L、(6.08±0.71)IU/L、(1.90±0.10)mmol/L、(1.83±0.09)mmol/L]相比,模型组小鼠肝组织出现脂肪变性,肝细胞肿大,脂肪滴增多等病变,小鼠血清中AST(18.81±1.14)IU/L、ALT活性(9.65±0.90)IU/L、肝组织中总胆固醇(2.48±0.08)mmol/L、三酰甘油含量(3.12±0.10)mmol/L及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量均升高,p-AMPK、p-LKB1、p-ACC蛋白相对表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,肝豆汤低、中、高剂量组小鼠肝组织病变依次减轻,血清AST[(16.30±1.18)IU/L、(14.020±1.15)IU/L、(12.20±1.12)IU/L]、ALT活性[(8.58±0.86)IU/L、(7.18±0.83)IU/L、(6.18±0.65)IU/L]、肝组织中总胆固醇[(2.36±0.11)mmol/L、(2.03±0.09)mmol/L、(1.91±0.10)mmol/L]、三酰甘油含量[(2.52±0.08)mmol/L、(1.96±0.09)mmol/L、(1.84±0.10)mmol/L]及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量依次降低,p-ACC、p-AMPK、p-LKB1蛋白相对表达量依次升高(P<0.05),东宝肝泰组小鼠血清中AST(14.52±1.16)IU/L、ALT活性(7.16±0.90)IU/L、肝组织中总胆固醇(2.01±0.09)mmol/L、三酰甘油含量(1.95±0.09)mmol/L及HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白相对表达量均降低,p-ACC、p-AMPK、p-LKB1蛋白相对表达量均升高(P<0.05),其中肝豆汤中剂量组与东宝肝泰组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝豆汤可改善高脂摄入引起的小鼠肝脏脂肪变性,其机制可能与激活LKB1/AMPK信号通路有关。

基于慢病毒系统构建AMPKα1过表达的3T3-L1细胞系

[目的]采用慢病毒系统构建AMP依赖的蛋白激酶α1(AMP activated protein kinase α1,AMPKα1)基因过表达的3T3-L1细胞系,探讨其对炎症因子表达水平的影响。[方法]在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上查找到AMPKα1的基因序列,利用SnapGene软件设计引物,进行目的基因扩增、纯化。将纯化后的AMPKα1片段克隆到PLJM1-EGFP载体质粒上,构建好的质粒与辅助质粒共同转染到HEK293T细胞中,收集病毒液。用含有病毒液的培养基培养3T3-L1细胞,待抗性蛋白表达后用嘌呤霉素筛选,杀死未成功转染的3T3-L1细胞,更换新鲜的完全培养基继续培养。[结果]成功构建稳定过表达AMPKα1的3T3-L1细胞系(P<0.05);AMPKα1过表达的3T3-L1细胞系的炎症因子MCP-1蛋白表达水平降低(P<0.05),炎症减轻。[结论]过表达3T3-L1细胞中的AMPKα1,减轻炎症因子MCP-1的表达水平(P<0.05)。

瑞马唑仑通过调节AMPK/SIRT1/PGC1α信号通路对脑缺血再灌注大鼠神经损伤的影响

目的探讨瑞马唑仑对脑缺血再灌注大鼠神经损伤的影响及可能机制。方法将大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组、瑞马唑仑组和AMPK抑制剂组,Longa评分评估大鼠神经功能,TTC染色测定脑组织梗死体积比,TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡,qRT-PCR法检测脑组织中AMPK/SIRT1/PGC1α通路相关mRNA表达,Western blot方法检测脑组织中AMPK/SIRT1/PGC1α通路相关蛋白表达。结果瑞马唑仑能降低脑缺血再灌注大鼠Longa评分及脑组织梗死体积比、细胞凋亡率,激活脑组织中AMPK/SIRT1/PGC1α通路,AMPK抑制剂削弱了瑞马唑仑对脑缺血再灌注大鼠的影响。结论瑞马唑仑能减轻脑缺血再灌注大鼠的神经损伤,其机制与激活AMPK/SIRT1/PGC1α信号通路有关。

一种降低dATP用量的简单易错PCR方法

易错PCR是基因体外诱变的主要方法之一,是通过在PCR体系中添加Mn2+、提高Mg2+浓度和dCTP/dTTP浓度等措施达到基因诱变的目的。【目的和方法】本研究在不添加Mn2+、不调整其它任何PCR成分的情况下,通过降低dATP浓度的底物不平衡作用,对洋葱抗菌蛋白基因Ace-AMP1和苏云金芽胞杆菌毒蛋白(Bt)基因cry1A(c)进行了PCR诱变。【结果】结果表明:随着dATP浓度的降低,序列变异率和碱基突变率均呈升高趋势。当dTTP/dCTP/dGTP∶dATP在20∶1-40∶1时,碱基突变率介于1.4%-1.8%之间,序列变异率介于77.8%-100%之间。【讨论和结论】该方法简化了常规易错PCR诱变中的条件优化过程,简单实用。降低dATP浓度的诱变方法主要引起AT→GC的变异,适用于提高靶基因GC含量的体外诱变。本研究降低单一底物浓度的诱变方法可以提高诱变基因的AT或GC含量,是对易错PCR诱变方法的拓展。

低氧诱导因子1α对成肌分化中PGC-1β的影响及机制研究

目的:研究低氧诱导因子HIF-1α在颏舌肌成肌分化和线粒体生物发生中的作用,探索可能的调控机制。方法:构建HIF-1α敲降质粒,慢病毒载体转染小鼠颏舌肌成肌细胞,设阴性对照组,用含2%马血清的分化培养基在低氧(1%O2)环境下诱导成肌细胞分化,western blot检测成肌细胞分化2、4、6 d,PGC-1β、AMPKα1、p AMPKα1的表达水平,免疫细胞化学染色观察低氧分化4 d时AMPK通道激活剂与阻滞剂对PGC-1β的表达影响,western blot定量分析。结果:1 HIF-1α敲降组的PGC-1β表达量高于对照组(P<0.05),且分化4 d时表达最高(P<0.05);2AMPKα1总蛋白表达量无明显差异,p AMPKα1的表达在HIF-1α敲降组远高于对照组(P<0.05)。3AMPK通路促进剂AICAR增加PGC-1β的表达(P<0.05),抑制剂Compound C明显抑制PGC-1β的表达(P<0.05)。结论:HIF-1α下调了低氧环境中PGC-1β的表达,PGC-1β的表达受AMPK通路的正向调节作用。