家蝇AMP17基因的克隆及其分子特性和表达模式研究

目的克隆家蝇AMP17基因并进行、序列分析,对其时空表达模式进行初步探索。方法从微生物诱导的家蝇转录组数据库中筛选差异高表达唾液腺蛋白AMP17基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板进行PCR扩增,运用生物信息学方法对其编码蛋白进行结构与功能分析。取家蝇不同生活史时期标本(卵,各龄幼虫,蛹,雄雌成虫)及3龄幼虫不同组织部位(体壁、气管、唾液腺、脂肪体、马氏管及中肠)标本,采用实时荧光定量PCR检测AMP17基因表达情况。结果 PCR扩增得到约495bp的特异性AMP17基因片段。AMP17基因ORF全长495bp,编码164个氨基酸,理论分子质量单位17.4×103,等电点为6.09,整个多肽链表现为亲水性。该蛋白属于分泌蛋白,主要分布在细胞外(包括细胞壁)。磷酸化位点分析该蛋白,有5个丝氨酸、3个苏氨酸、1个色氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。其二级结构中主要以α-螺旋,不规则卷曲和延伸链为蛋白最大量的结构元件。时空表达谱显示,家蝇不同发育时期中,以卵期作为参照,AMP17基因在3龄及雄成虫时期表达量高,表达水平排列顺序为3龄幼虫>雄成虫>1龄幼虫>雌成虫>蛹期>2龄幼虫>卵,3龄幼虫时期表达量比卵期上调了20 320.98倍(P<0.01);雄成虫上调了10 936.37倍(P<0.01)。以体壁作为参照,AMP17基因在家蝇3龄幼虫不同组织的表达以马氏管表达最高,比体壁上调了2.40倍(P<0.05);其次为唾液腺,比体壁上调了1.31倍(P<0.01)。结论成功克隆了家蝇AMP17基因并初步探索了其时空表达模式,为进一步研究其功能奠定了基础。

经白色念珠菌胁迫后家蝇新型抗菌肽AMP17表达模式的研究

目的:探讨家蝇幼虫经白色念珠菌Candida albican胁迫后,AMP17基因时空表达谱的变化。方法:显微注射法将白色念珠菌导入家蝇幼虫体内,饲养3 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后,提取各组整虫RNA,采用实时荧光定量PCR分析AMP17的时间表达情况;选取经胁迫后3 h、12 h、48 h的幼虫,解剖获得体壁、脂肪体、马氏管、中肠、唾液腺、气管、血淋巴,同上分析AMP17的空间表达情况。以注射PBS为对照组,家蝇RPS18为内参基因,设3个生物重复。结果:注射白色念珠菌后,实验组幼虫的AMP17基因表达量较对照组明显上调,高表达一直持续到12 h,24 h明显下降,但48 h表达量又突然大幅度升高。不同组织中实验组与对照组比较,3 h时体壁表达量最高,上调6. 59倍(P<0. 01),其次是气管上调4. 74倍;感染12 h后,体壁表达量依然最高,上调了5. 54倍(P<0. 01),其次为血淋巴,上调了1. 87倍(P<0. 05);感染48 h后,体壁表达量上调了10. 98倍(P<0. 05);唾液腺上调了7. 28倍(P<0. 05)。结论:经白色念珠菌胁迫后,AMP17基因的表达量出现了明显的上调,提示该基因参与了家蝇应对真菌侵染的免疫反应。