诸葛菜种子水提物激活AMPK/AKT/GSK-3β通路保护对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤

本文研究诸葛菜种子水提物对对乙酰氨基酚(APAP)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用。健康雄性C57 BL/6J小鼠被随机分为7组:正常组,模型组,双环醇阳性对照组(200 mg/kg),葵花护肝片阳性对照组(350 mg/kg),诸葛菜种子水提物低(125 mg/kg)、中(250 mg/kg)、高(500 mg/kg)剂量组。各组均灌胃给药,1次/d,连续灌胃给药4 d,除正常组外其余各组均腹腔注射APAP溶液(450 mg/kg)建立急性肝损伤模型,处死小鼠。检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),谷草转氨酶(AST)活性与胆红素(TBIL)水平;肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH);HE染色观察小鼠肝组织病理变化;蛋白印迹法检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化AKT蛋白(p-AKT)、磷酸化葡萄糖合成激酶3β(p-GSK-3β)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-9抗体(Caspase-9)、活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3抗体(Caspase-3)蛋白的表达。与模型组相比,诸葛菜各剂量组均能明显改善肝脏病理变化,中剂量组ALT,AST活性分别降低了48.73%、59.11%,高剂量组分别降低了71.38%、59.33%,中剂量组SOD和GSH分别上升了45.05%、219.45%,高剂量组SOD和GSH分别上升了48.68%和232.80%,同时可致肝组织中p-JNK、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平显著减少,Bcl-2、p-AMPK、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达水平显著增加。其机制可能与AMPK/AKT/GSK-3β信号通路被激活有关。

藏红花素通过PI3K/Akt/GSK-3β通路诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究

目的:探讨藏红花素对人乳腺癌细胞凋亡的影响及相关调控机制。方法:以人正常乳腺MCF-10A细胞和人乳腺癌MCF-7细胞为受试细胞,分别以不同浓度藏红花素0(空白对照组)、200、400、800 mg/L和LY294002(PI3K特异性抑制剂)15 mg/L干预对数生长期MCF-10A细胞和MCF-7细胞48 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验分别检测各组细胞增殖抑制率、细胞克隆能力,Annexin V-FITC染色法检测细胞凋亡水平,运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic proteases-9,Caspase-9)、激活型半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteine aspartate protease-3,Cleaved caspase-3)、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(bcl-2 related X protein,Bax)蛋白表达。结果:与空白对照组比较,200、400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-10A细胞增殖抑制率、克隆数目、凋亡率,差异均无统计学意义(P>0.05);400、800 mg/L藏红花素组和LY294002组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.01);p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Bcl-2表达下调且Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.01),磷酸化率p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β降低(P<0.01),Bax/Bcl-2表达比值升高(P<0.01)。与LY294002组比较,800 mg/L藏红花素组MCF-7细胞增殖抑制率升高、克隆数目降低、凋亡率升高(P<0.05或P<0.01);Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表达上调(P<0.05或P<0.01),Bax/Bcl-2比值升高(P<0.01),其他指标两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:藏红花素具有诱导人乳腺癌细胞凋亡的作用,其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路有关。

中药复方金思维含药血清调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对拟阿尔茨海默病细胞模型tau蛋白磷酸化的影响

目的探讨中药复方金思维含药血清对拟阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)细胞模型tau蛋白磷酸化的影响及作用机制。方法采用Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立拟AD细胞模型,CCK-8法筛选金思维含药血清、PI3K/AKT/GSK-3β通路抑制剂LY294002最佳作用浓度。将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组、金思维低剂量组、金思维中剂量组、金思维高剂量组以及LY294002组。蛋白免疫印迹法检测金思维含药血清对SH-SY5Y细胞tau蛋白磷酸化以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相关蛋白的影响。结果20μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24 h可建立最佳拟AD细胞模型。相对于正常组,模型组P-AKT显著降低(P<0.05),P-tau显著升高(P<0.01)。相对于模型组,金思维低剂量含药血清组PI3K的表达量显著升高(P<0.05),高剂量含药血清组GSK-3β的表达量显著降低(P<0.05),中剂量和高剂量含药血清组P-tau的表达量显著降低(P<0.01、P<0.001)。加入通路抑制剂LY294002后,P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT、GSK-3β、P-tau蛋白的表达量较模型组差异无统计学意义(P>0.05)。结论金思维含药血清可降低拟AD细胞模型tau蛋白磷酸化水平,其机制可能与PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有关。

化瘀消痞汤对大鼠萎缩性胃炎癌前病变及PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响

目的探讨化瘀消痞汤对大鼠萎缩性胃炎癌前病变的作用以及对PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响。方法60只SPF级SD雄鼠随机挑选10只为空白组,其余大鼠采用多因素造模法制备萎缩性胃炎癌前病变模型。造模成功后随机分为模型组,化瘀消痞汤高、中、低剂量组(24.8、12.4、6.2 g/kg),叶酸组(2 mg/kg),每组10只,连续给药90 d。造模及给药期间观察大鼠一般状况、记录体质量及3 h进食量;HE染色观察大鼠胃组织形态变化;ELISA法检测大鼠胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平;免疫荧光法检测大鼠胃组织Ki67蛋白表达;Western blot法检测大鼠胃组织PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、β-catenin、CDK4蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠萎靡倦怠,体质量、3 h进食量降低(P<0.05),胃黏膜明显变薄,腺体数量明显减少且排列紊乱,肠上皮化生明显,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平升高(P<0.05),胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达升高(P<0.05),p-GSK-3β蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠一般状况有所好转,体质量、3 h进食量增加(P<0.05),胃黏膜修复,腺体数量增多且排列趋于整齐,肠上皮化生减轻,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平降低,胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达降低,p-GSK-3β蛋白表达升高,以化瘀消痞汤高、中剂量组更明显(P<0.05);与叶酸组比较,化瘀消痞汤高、中剂量组体质量、3 h进食量增加(P<0.05),胃黏膜形态和腺体数量逐渐趋于正常,胃组织匀浆液Cyclin D1、c-Myc水平降低(P<0.05),胃组织Ki67、PI3K、p-Akt、β-catenin、CDK4蛋白表达降低(P<0.05),高剂量组大鼠胃组织p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05)。结论化瘀消痞汤可抑制萎缩性胃炎癌前病变大鼠胃上皮细胞异常增殖,改善胃黏膜损伤,其机制可能与调控PI3K/Akt/GSK-3β信号通路中关键因子表达有关。

山奈酚调节AKT/GSK-3β/Snail信号通路对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨山奈酚对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响,并探究其作用机制。方法:将CNE-2细胞分为对照组、山奈酚低浓度组、山奈酚中浓度组、山奈酚高浓度组、山奈酚高浓度+SC-79(AKT激活剂)组。CCK-8法和克隆实验测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测各蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化Akt(p-AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、Snail的表达水平。构建鼻咽癌裸鼠模型,分为裸鼠NC组、山奈酚组、山奈酚+SC-79组,测量肿瘤质量与体积,免疫组化法检测移植瘤组织p-AKT、p-GSK-3β、Snail蛋白表达。结果:山奈酚对人鼻咽癌上皮细胞活力无显著影响(P>0.05);鼻咽癌细胞活力随着山奈酚浓度的升高而逐渐降低(P<0.05),选择CNE-2作为后续实验细胞,选择25、50、100μmol/L山奈酚作为后续实验浓度。与对照组相比,山奈酚低、中、高组细胞活力、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、Snail水平显著下降,凋亡率、Bax、Caspase-3、E-cadherin上升(P<0.05);与山奈酚高浓度组相比,山奈酚高浓度+SC-79组细胞活力、Bcl-2、N-cadherin、Vimentin、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、Snail水平显著上升,凋亡率、Bax、Caspase-3、E-cadherin下降(P<0.05)。山奈酚能抑制移植瘤质量和体积,降低p-AKT、p-GSK-3β、Snail蛋白表达(P<0.05);SC-79逆转山奈酚对移植瘤的抑制作用,促进AKT/GSK-3β/Snail通路蛋白表达(P<0.05)。结论:山奈酚能抑制鼻咽癌细胞增殖和EMT,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制AKT/GSK-3β/Snail信号通路有关。

下调Ppp1r17对小鼠饮酒相关行为及AKT/GSK-3β/CREB信号通路磷酸化的影响

目的:观察下调蛋白磷酸酶1调节因子亚基17(Ppp1r17)对小鼠饮酒相关行为的作用,并分析其对蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)通路磷酸化的影响。方法:取40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组(n=10):control组;shPpp1r17①组;shPpp1r17②组和shPpp1r17③组。给予AAV-shPpp1r173周后检测其在海马组织中的mRNA和蛋白表达水平。取20只雄性C57BL/6J小鼠随机分为control组和shPpp1r17组(n=10)。注射AAV-shPpp1r173周后进行旷场实验、条件性位置偏好实验和翻正反射实验,并检测AAV-shPpp1r17定位及蛋白表达情况。取20只雄性C57BL/6J小鼠分为4组(n=5):shNC+Water组、shNC+EtOH组、shPpp1r17+Water组和shPpp1r17+EtOH组,其中EtOH组小鼠稳定自主饮用9%酒精30 d。Western blot检测Ppp1r17、p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、p-CREB和CREB蛋白表达情况。结果:(1)实时荧光定量PCR结果显示下调序列shPpp1r17①为最佳Ppp1r17下调序列。(2)行为学结果显示,shPpp1r17组小鼠以增强运动能力和减少焦虑样情绪为特征,Ppp1r17下调可以增加饮酒CPP分数,并降低小鼠对酒精的敏感性。(3)免疫荧光结果显示,shPpp1r17可以在海马脑区特异性表达。(4)Western blot结果显示,在慢性酒精暴露后,Ppp1r17蛋白表达、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β和p-CREB/CREB的比值均显著增加。而在海马敲减Ppp1r17后,Ppp1r17蛋白表达显著降低,并且增强AKT/GSK-3β/CREB通路的活性。结论:Ppp1r17下调后可以增强酒精对小鼠的奖赏效应、增强小鼠的运动能力并降低小鼠对酒精的敏感性,其机制可能与激活AKT/GSK-3β/CREB信号通路有关。

和枢消积方通过调节AsTP3正反馈AKT/GSK-3β/mTOR信号通路对人肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨和枢消积方通过调节三氧化二砷反式激活蛋白3(AsTP3)对人肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡的作用机制。方法:体外培养SMMC-7721肝癌细胞,采用CCK8法筛选出和枢消积方最适浓度,联合CCK8法与平板克隆形成实验检测细胞增殖,细胞划痕实验及Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力,流式细胞实验检测细胞凋亡,qRT-PCR检测细胞AsTP3 mRNA水平,Western Blot检测细胞中AsTP3、AKT、GSK-3β、mTOR蛋白相对表达量及磷酸化水平。结果:与对照组比较,和枢消积方能抑制SMMC-7721细胞增殖、迁移、侵袭及克隆能力,促进SMMC-7721细胞凋亡(P<0.05);和枢消积方可下调SMMC-7721细胞内AsTP3、P-AKT、P-GSK-3β、P-mTOR、Bcl2的mRNA表达及蛋白水平并上调Bax蛋白的表达。结论:和枢消积方能抑制SMMC-7721细胞增殖,促进其凋亡,其机制可能与下调AsTP3表达从而抑制AKT/GSK-3β/mTOR信号通路有关。

基于PI3K/AKT/Gsk-3β通路研究山药多糖对运动疲劳小鼠的影响

研究山药多糖(Dioscorea opposita Thunb.polysaccharides,DTPs)对运动疲劳小鼠的抗疲劳作用及作用机制。采用力竭游泳结合疲劳转棒方法建立小鼠运动疲劳模型,分析小鼠力竭游泳时间和体重变化、疲劳代谢产物积累、相关酶活力水平、肝脏组织结构和肌肝糖原变化。结果表明:山药多糖能显著延长小鼠力竭游泳时间,减轻小鼠体重下降和肝脏损伤,显著降低血清乳酸(LD)、尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)含量并显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活力及肌糖原(MuG)和肝糖原(LG)含量,同时显著降低谷草转氨酶(AST)水平;此外,给药组显著上调骨骼肌中磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)mRNA表达、显著降低蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)和糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3 beta,Gsk-3β)的表达。综上,山药多糖能减少代谢产物积累、通过调节PI3K/AKT/Gsk-3β通路促进糖原合成来改善运动疲劳。

PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在高尿酸血症大鼠尿酸、血糖及脂质代谢中的作用机制

目的 研究PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在高尿酸血症大鼠尿酸、血糖及脂质代谢中的作用机制。方法 取40只SD大鼠随机分为4组,其中2组为未建模SD大鼠,分别为模型对照组(C组)、LY294002组(L组),剩余2组为建模成功的SD大鼠,分为高尿酸血症组(H组)和高尿酸血症加LY294002干预组(HL组)。C组大鼠经口给予纯水(10 mL/kg体重)和腹腔注射0.2%二甲基亚砜溶液(6 mL/kg体重);L组大鼠给予相同剂量的纯水和腹腔注射LY294002溶液(6 mL/kg体重);H组大鼠经口给予腺嘌呤(100 mg/kg体重)和乙胺丁醇(250 mg/kg体重);HL组大鼠在给予相同剂量的腺嘌呤和乙胺丁醇的同时腹腔注射LY294002溶液(6 mL/kg体重)。各组持续干预15 d,每3天从眼眶静脉丛采集血样,测定血尿酸(Uric Acid, UA)、肌酐(Serum Creatinine, Scr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen, BUN)、血糖(Glucose, GLU)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、胆固醇(Total Cholesterol, TC)。第15天麻醉后采集各组大鼠肾脏组织,采用荧光定量PCR法和Western blotting法检测大鼠肾脏组织中PI3K/AKT/GSK-3β的表达水平。结果 4组C组、L组、H组和HL组大鼠实验前血清尿酸、肌酐、尿素氮、血糖、甘油三酯和胆固醇水平差异无统计学意义(P<0.05)。H组和HL组大鼠UA、Scr、BUN水平在实验后均高于C组和L组,与C组第6天比较,H组和HL组UA水平降低,第9天至第15天UA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。L组、H组和HL组GLU水平较C组升高,其中L组在第12天,GLU水平高于C组,H组和HL组在实验第6天,GLU水平高于L组,差异有统计学意义(P均<0.05)。H组和HL组TC、TG水平较H组和L组升高,其中HL组在实验第9天,TG水平高于H组,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR检测结果显示,与C组比较,H组和HL组PI3K、AKT、GSK-3β增大,L组AKT减小,差异有统计学意义(P均<0.05)。与L组比较,H组和HL组PI3K、AKTGSK-3β增大,差异有统计学意义(P均<0.05)。与H组比较,HL组PI3K、AKT和GSK-3β增大,差异有统计学意义(P均<0.05)。Western-Blot结果显示,与C组比较,H组和HL组PI3K、AKT、GSK-3β增大,差异有统计学意义(P均<0.05)。与L组比较,H组和HL组PI3K、AKTGSK-3β增大,差异有统计学意义(P均<0.05)。与H组比较,HL组PI3K、AKT和GSK-3β增大,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 PI3K/AKT/GSK-3β信号通路与高尿酸血症之间存在联系,提示该通路对治疗和预防高尿酸血症具有重要意义。

槲皮素基于PI3K/AKT/GSK-3β/β-Catenin通路改善Dox诱导小鼠心肌损伤的机制

目的:研究槲皮素(Que)改善多柔比星(Dox)所致小鼠心肌损伤作用机制。方法:将50只小鼠随机分为正常组(Control)、模型组(Dox)、槲皮素低、中、高剂量组(Que-L、Que-M、Que-H),除Control外腹腔注射Dox建立心肌损伤模型。心脏超声及血流动力学评价小鼠心脏功能,ELISA法检测小鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)与乳酸脱氢酶(LDH)含量,HE染色、Tunel染色、WGA染色分别观察小鼠心肌组织病理变化、心肌细胞凋亡、心肌细胞横截面积变化;免疫荧光检测心肌组织中p-GSK-3β表达,Western blot法检测小鼠心肌组织PI3K/AKT/GSK-3β通路与凋亡蛋白表达。结果:与Control组比较,Dox组小鼠左室射血分数(LVEF)与左室短轴缩短率(LVFS)极显著下降(P<0.01),左心室舒张末期内径(LVEDd)与左心室收缩末期内径(LVEDs)极显著增加(P<0.01),血清中CK-MB与LDH含量极显著增加(P<0.01),心肌细胞肿胀且排列紊乱;心肌组织中PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin表达极显著降低(P<0.01),Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达极显著增加(P<0.01)。与Dox组比较,Que各给药组小鼠心肌损伤均有不同程度改善,LVEF与LVFS极显著升高(P<0.01),(LVEDd)与(LVEDs)极显著降低(P<0.01),血清中CK-MB、LDH含量极显著减少(P<0.01),心脏功能增强;心肌细胞肿胀、凋亡、纤维增生减轻,心肌组织中PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达极显著升高(P<0.01),PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin被激活,凋亡蛋白Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表达极显著降低(P<0.01),其中Que-H组治疗效果最佳。结论:Que具有一定的心肌保护作用,可通过激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路改善Dox引起的心肌损伤与凋亡。

miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血大鼠神经元铁死亡

目的:探讨miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进脑出血(ICH)大鼠神经元铁死亡的机制。方法:使用大鼠神经元细胞为研究对象,采用氧合血红蛋白(oxyHb)刺激神经元细胞构建ICH体外细胞模型,分别将miR-152-3p inhibitor和(或)PIK3CA抑制剂分别处理细胞,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,RT-qPCR、Western blot检测相关基因和蛋白表达情况;并用细胞免疫荧光观察Nrf2蛋白的入核率;用双荧光素酶靶标实验验证miR-152-3p与PIK3CA的关系。结果:将miR-152-3p inhibitor转染的细胞构建ICH细胞模型后,细胞凋亡率明显降低(P<0.01);SLC7A11、GPx4、PIK3CA、Nrf2蛋白表达水平以及p-AKT/AKT比率显著升高而GSK-3β蛋白表达水平显著降低(P<0.01);同时,Nrf2蛋白入核量也显著升高(P<0.01);而此作用在使用PIK3CA抑制剂干预后,miR-152-3p inhibitor的改善效果消失;荧光素酶靶标实验证实,miR-152-3p可靶向调控PIK3CA。结论:miR-152-3p通过AKT/GSK-3β/Nrf2信号通路促进ICH大鼠神经元铁死亡。

槲皮素调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路抑制C2C12细胞凋亡

目的:基于AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路探讨槲皮素对C2C12细胞增殖、成肌分化和凋亡的影响。方法:体外培养C2C12细胞进行成肌诱导,分别采用CCK8法(Cell Counting Kit-8)、ATP染色法及TUNEL法检测槲皮素对C2C12细胞增殖活力、成肌能力和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,筛选合适浓度。再采用合适浓度的槲皮素或AKT1通路抑制剂(LY294002)干预成肌诱导后的C2C12细胞,ATP法和TUNEL法分别检测C2C12细胞成肌能力和凋亡水平,Western blot检测p-AKT1、p-AMPK和p-Foxo3a蛋白表达水平。结果:①在一定范围内,槲皮素呈浓度依赖性促进C2C12增殖,12.5μmol/L的槲皮素显著促进C2C12细胞成肌分化,能显著提高成肌标志物MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,因此本研究选择12.5μmol/L的槲皮素用于后续研究。②10μmol/L LY294002显著抑制C2C12细胞成肌分化,促进细胞凋亡,抑制p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,促进p-Foxo3a蛋白表达;12.5μmol/L槲皮素联合10μmol/L LY294002显著促进C2C12细胞成肌分化,抑制细胞凋亡,促进p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,抑制p-Foxo3a蛋白表达。结论:槲皮素通过调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路的磷酸化促进C2C12细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

辣椒素纳米胶囊通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β途径改善心肌纤维化的研究

目的探讨辣椒素纳米颗粒(Capsaicin/Nanoparticles,Cap/NPs)胶囊对大鼠心肌梗死后心肌纤维化及磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(Phosphatidylinositol Kinase 3-Kinase/Protein Kinase B/Glycogen Synthase Kinase 3β,PI3K/Akt/GSK-3β)信号通路的影响。方法于2022年1月—2023年6月自贵州医科大学动物中心购进40只雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠,在适应性喂养7 d后,按随机数表法分为4组(正常对照组、假手术组、模型组、干预组),每组10只。正常对照组、假手术组、模型组予以生理盐水,干预组予以Cap/NPs胶囊口服,1次/周,连续4周。对模型组与干预组行手术结扎,构建心肌梗死模型,假手术组则开展相同手术操作不予以结扎处理,对照组为正常大鼠。术后4周,观察各组心肌纤维化情况,检测PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白在大鼠心肌组织中表达情况。结果模型组血清激活素A(Activin A,ACT-A)水平为(2.33±0.28)pg/mg、心房钠尿肽(Atrial Natriuretic Peptide,ANP)水平为(2.21±0.57)pg/mg、脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide,BNP)水平为(212.04±17.36)ng/L、基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinases,MMP-9)水平为(221.65±23.34)ng/L、胶原纤维蛋白Ⅲ水平为(67.62±1.85)ng/mL,各指标均明显高于干预组,差异有统计学意义(P均<0.05)。模型组大鼠心肌组织PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达水平明显低于干预组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠心肌梗死模型建立后予以Cap/NPs胶囊干预,能够有效抑制心肌纤维化发展,减轻大鼠心肌损伤,其机制与PI3K、Akt、GSK-3β蛋白活性调控以及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路传导抑制有关。

人参皂苷Rh2调控PI3K/AKT/GSK-3β信号通路诱导人结肠癌细胞凋亡

目的探究人参皂苷Rh2(ginsenoside Rh2,Rh2)诱导人结肠癌细胞SW480凋亡作用机制。方法 CCK-8法检测Rh2对SW480细胞增殖的影响;流式细胞术(Flow cyto Metry,FCM)检测Rh2对SW480细胞凋亡的影响;Hoechst33258染色观察Rh2对SW480细胞凋亡形态学的影响;Western blot检测经Rh2诱导SW480细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、p53、cleaved caspase-3,PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GSK-3β、P-GSK-3β表达量变化;LY294002、Rh2单独及联合诱导SW480细胞后,蛋白PI3K、AKT、P-AKT、GSK-3β、P-GSK-3β表达量变化。结果CCK-8结果显示Rh2呈时间浓度依赖抑制SW480细胞增殖。FCM结果显示细胞早期凋亡率由正常对照组的(0.70±0.09)%增至(11.06±1.04)%(P<0.05)。Hoechst33258结果显示,Rh2诱导SW480细胞48h后呈现典型的凋亡形态学改变。Western blot结果显示,经Rh2诱导的SW480细胞,凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低,Bax、p53、激活型胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)蛋白表达增加;PI3K/AKT/GSK-3β信号通路蛋白PI3K、P-AKT、P-GSK-3β表达量与对照组比较明显减少,AKT、GSK-3β表达量无明显变化;LY294002、Rh2和LY294002与Rh2联合诱导SW480细胞后,总AKT蛋白和总GSK-3β蛋白表达量基本一致,LY294002与Rh2联合用药对SW480细胞中PI3K、P-AKT和P-GSK-3β的表达抑制作用较单独用药更加明显。结论Rh2可能是通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路,激活p53信号通路,激活caspase-3,破坏Bcl-2/Bax比例,诱导结肠癌细胞SW480凋亡。

葛根芩连汤含药血清对L6肌细胞胰岛素抵抗模型中PI3K、Akt、GLUT4、AMPK蛋白的影响

目的通过观察葛根芩连汤含药血清对L6骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、葡萄糖转运子4(GLUT4)的影响,探讨葛根芩连汤抗2型糖尿病胰岛素抵抗的信号通路相关机制。方法将诱导分化好的L6肌细胞接种于6孔板内,以1μmol/L DEX诱导L6肌细胞24 h产生胰岛素抵抗,予以不同浓度的葛根芩连汤含药血清(20%、10%和5%),采用western blot法检测L6骨骼肌细胞p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AMPK、GLUT4蛋白的表达。另设实验,分组方法如上,采用ELISA法检测膜蛋白GLUT4含量。结果葛根芩连汤含药血清(20%、10%和5%)(高、中和低剂量组)治疗后,p-PI3K、Akt、p-Akt、p-AMPK、GLUT4蛋白的表达明显升高(P<0.05);用葛根芩连汤含药血清(20%、10%和5%)(高、中和低剂量组)治疗后,膜GLUT4蛋白的表达明显升高(P<0.05)。结论葛根芩连汤抗2型糖尿病胰岛素抵抗作用可能与影响PI3K、Akt、GLUT4、AMPK蛋白相关。

低温胁迫对鱼类PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的影响

为探讨PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在鱼类低温胁迫中的分子机制,利用3种抗寒能力不同的鱼类:斑马鱼(Danio rerio)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus),对其进行低温胁迫(8℃),监测这3种鱼鱼鳃中PI3K/AKT/GSK-3β信号通路中蛋白表达情况。结果表明:1)在相同低温胁迫下,3种鱼运动能力为:草鱼>斑马鱼>罗非鱼;2)Western blot结果表明:在罗非鱼中,低温抑制了p-PTEN蛋白的表达;诱导了AKT、p-AKT(Ser 473)和p-GSK-3β(Ser 9)蛋白的表达。在斑马鱼和草鱼中,低温都抑制了AKT和p-AKT(Ser473)蛋白的表达;诱导了p-GSK-3β(Ser 9)蛋白的表达。尽管低温一致性诱导p-GSK-3β(Ser 9)在3种鱼中的表达,但其呈现不同的变化倍数:罗非鱼中p-GSK-3β蛋白的上升倍数显著高于其他两种鱼。低温诱导了PI3K/AKT/GSK-3β信号通路,在不同低温耐受能力的鱼中呈现出不同的表达模式,这些物种特异性的表达模式可能会影响鱼类低温下不同的耐受能力。

红景天苷对局灶性脑缺血/再灌注大鼠轴突再生及Akt/GSK-3β/CRMP-2表达的影响

目的研究红景天苷对局灶性脑缺血/再灌注大鼠轴突再生的影响及可能的机制。方法健康成年♂SD大鼠36只,随机分为假手术组、模型对照组、红景天苷给药组,用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注大鼠模型(MCAO),ZeaLonga标准评分法评价大鼠神经功能损伤,Western blot法检测大鼠缺血侧脑组织p-Akt(Ser473)、Akt、p-GSK-3β(Ser9)、GSK-3β、p-CRMP-2(Thr514)、CRMP-2蛋白的表达,免疫荧光染色法检测大鼠缺血侧脑组织NF200蛋白的表达。结果与MCAO组比较,红景天苷能明显改善大鼠的神经功能损伤,促进NF200、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表达,抑制p-CRMP-2蛋白表达。结论红景天苷能改善局灶性脑缺血/再灌注大鼠的神经功能缺损,此作用可能与促进Akt、GSK-3β的磷酸化,抑制CRMP-2的磷酸化,进而促进轴突再生有关。

齐墩果酸预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中PI3K-AKT-GSK-3β信号传导通路的影响

目的:齐墩果酸(oleanolic acid,OA)预处理可使大鼠肝糖原增加并使肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemic reperfu-sion injury,HIRI)减轻,但机制不详。本研究拟探讨OA预处理对大鼠HIRI前后的PI3K-AKT-GSK-3β信号传导通路的影响。方法:128只SD大鼠随机分为假手术组(SH组)、缺血再灌注组(IR组)、0.5%羧甲基纤维素钠组(CM组)和齐墩果酸预处理组(OA组)。OA组以100mg/kg的齐墩果酸混悬液,SH和IR组以相同容积的水,CM组以相同容积的0.5%CMC-Na分别每日灌胃1次,连续7天。第8天建立70%肝脏缺血再灌注模型,肝脏缺血60min后行再灌注。于术前(第8天)、再灌注0、3、6h取肝组织。用Western blot法测定肝组织的p-PI3K(p85)、p-AKT(ser473)、AKT、p-GSK-3β(ser9)、GSK-3β的蛋白表达量。结果:术前、再灌注0h时,OA组的p-PI3K(p85)、p-AKT(ser473)、p-GSK-3β(ser9)的蛋白表达量分别比其他3组明显增加(P<0.05);此时SH组、IR组、CM组的各蛋白表达量之间比较未见统计学差异(P>0.05)。再灌注3、6h时,OA组的p-PI3K(p85)、p-AKT(ser473)、p-GSK-3β(ser9)蛋白含量分别比其他3组显著增加(P<0.05),SH组相应时点的各蛋白含量均比其他3组的含量明显降低(P<0.05),IR组与CM组相应时点的各蛋白含量之间比较未见差异(P>0.05);各组的AKT与GSK-3β蛋白含量在各个时间点之间均未见统计学差异(P>0.05)。结论:OA预处理可使HIRI前后的p-PI3K(p85)、p-AKT(ser473)和p-GSK-3β(ser9)蛋白含量增加,激活肝脏PI3K-AKT-GSK-3β信号通路,此可能是OA减轻HIRI的机制之一。

Akt/GSK-3β/Snail通路在TGF-β_1诱导A549/DDP细胞上皮间质转化中的作用

目的:通过观察转化生长因子β_1(TGF-β_1)诱导前后Akt/GSK-3β/Snail信号通路相关分子的表达情况,探讨A549/DDP细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制。方法:TGF-β_1(5μg/L)作用48 h,观察A549/DDP细胞的形态变化,并测定EMT标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的表达情况,评估TGF-β_1是否成功诱导A549/DDP细胞发生EMT。进一步将A549/DDP细胞分为TGF-β_1(+)组、TGF-β_1(-)组和LY294002组,应用Western blot法检测各组Akt/GSK-3β/Snail通路相关分子Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平。结果:形态学观察可见TGF-β_1(+)组的细胞变得更加狭长,呈纺锤形,细胞间较为疏散,形态与间充质细胞相似。与TGF-β_1(-)组比较,TGF-β_1(+)组E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin蛋白表达上调(P<0.05);各组间Akt和GSK-3β的蛋白表达水平并无明显差别,TGF-β_1(+)组的p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail蛋白水平较TGF-β_1(-)组明显增强(P<0.05);PI3K抑制剂LY294002与TGF-β_1同时刺激细胞后,p-Akt、p-GSK-3βSer9和Snail的蛋白水平较TGF-β_1(+)组下调(P<0.05)。结论:TGF-β_1干预Akt/GSK-3β/Snail信号通路,促进Akt和GSK-3β的磷酸化,提高Snail的表达水平,诱导A549/DDP细胞发生EMT。

黄芩苷调控PI3K/AKT/GSK-3β途径对人结肠癌细胞生物学行为的影响

目的探究黄芩苷调控PI3K/AKT/GSK-3β途径对人结肠癌细胞生物学行为的影响机制。方法将SW620细胞分别在黄芩苷终浓度为0、5、10、20、30、40、50、100μmol/L下培养细胞,使用CCK-8法检测细胞活力。然后将SW620细胞分为3组,即对照组、黄芩苷组和黄芩苷+LY294002组。黄芩苷组和黄芩苷+LY294002组在含有终浓度为50μmol/L的黄芩苷中培养。黄芩苷+LY294002组的培养基中另外加入终浓度为2μg/mL的PI3K抑制剂LY294002。检测黄岑苷对SW620细胞生物学行为的而影响,并通过qPCR和Western Blot检测PI3K、AKT、GSK-3β的mRNA和蛋白。结果在黄芩苷浓度为50μmol/L时可最大的抑制结肠癌细胞的细胞活力。黄芩苷会显著的抑制结肠癌细胞的细胞活力、增殖、迁移、侵袭和血管生成能力,并促进细胞的凋亡。但是在使用LY294002抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路后,黄芩苷对结肠癌除血管生成外的其他生物学行为的抑制作用不显著。黄芩苷可显著抑制PI3K、AKT、GSK-3β的mRNA和蛋白磷酸化的水平,加入LY294002后会进一步抑制蛋白磷酸化的水平,但是对PI3K、AKT、GSK-3βmRNA影响不明显。结论黄芩素具有调控结肠癌细胞生物学行为的作用,包括抑制增殖、迁移侵袭、血管生成和促进凋亡,并且黄芩素的这种作用可能与其具有抑制PI3K/AKT/GSK-3β通路的作用有关。