AMPK/NRF2/NQO1信号通路与SD大鼠酒精性心肌病的相关性研究

目的明确单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶/核因子E2相关因子2/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶醌1(Adenosine monophosphate dependent protein kinase/nuclear factor E2-related factor 2/NADPH dehydrogenase quinone 1,AMPK/NRF2/NQO1)信号通路与SD大鼠的酒精性心肌病(alcoholic myocardiopathy,ACM)的关系。方法选用健康的8周龄SD大鼠构建ACM模型,采用随机数字表法分成2组,全价颗粒饲料+饮水组(对照组n=24只),全价颗粒饲料+饮酒组(实验组n=24只)。实验组大鼠于每日10:00、17:00给予定量[20 g/(kg·d)]20%浓度酒精喂养(灌胃);正常对照组同时给予等量蒸馏水(灌胃)。从造模开始,实验组以20%酒精浓度持续喂养12周。记录大鼠一般情况。分别于第4周、第8周、第12周实施超声心动图与病理分析。马松染色(Masson)检测大鼠心肌纤维化,免疫组化及RT-qpcr法检测大鼠心肌组织中AMPK、NRF2、NQO1蛋白及基因的表达,分析其关系,从蛋白及基因水平探讨ACM的发病机制。结果心脏彩超:实验组大鼠与对照组相比左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)均下降(P<0.05);病理:对照组HE染色无异常,实验组心肌细胞出现充血水肿等变性;Masson染色:与对照组相比,实验组大鼠心肌纤维化加重;免疫组化:与对照组相比,实验组大鼠心肌AMPK、NRF2、NQO1蛋白表达减弱,染色变浅;RT-qpcr:与对照组相比,实验组大鼠心肌AMPK、NRF2、NQO1基因表达减弱(P<0.05)。结论大鼠心肌纤维化及损伤程度与饮酒时间及浓度积累呈正相关,随着饮酒时间的延长,酒精在体内蓄积,心肌纤维化及损伤程度更严重,抑制AMPK/NRF2/NQO1信号通路可能是分子机制。

督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠Nrf2/HO-1/NQO1信号通路的影响

目的观察督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠创面修复及核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/NADPH醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)信号通路的影响。方法选取50只SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组,每组10只。除假手术组外,其余4组借助压力装置构建压力性损伤大鼠模型。分组干预并记录各组大鼠的压力性损伤修复情况及创面组织病理变化;借助ELISA检测各组大鼠的血清炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6以及氧化应激因子丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平;Western blot与RT-PCR检测各组大鼠创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白及mRNA的表达水平。结果HE染色结果显示:假手术组皮肤结构未被破坏;模型组创面肉芽组织可见明显的细胞坏死、变性及炎性细胞浸润;干预各组可见创面修复,表现为散在炎性细胞浸润,“气球样”坏死变性明显减少。Masson染色结果显示:假手术组创面皮肤组织胶原纤维较为整齐;模型组创面肉芽组织可见大面积的胶原纤维沉积、紊乱;干预各组可见不同程度的创面修复。与假手术组对比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及mRNA的表达水平均升高(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平均下降(P<0.05);与模型组比较,水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平均下降(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及m RNA的表达水平均升高(P<0.05),且联合干预组较其他干预组更优(P<0.05)。结论督脉隔药灸可有效促进压力性损伤的创面修复,与水凝胶多功能复合敷料联合使用效果更佳,其机制可能与督脉隔药灸抑制创面炎性反应及氧化应激,并激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路相关。

神经生长因子联合BMSCs-源外泌体通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路缓解脑出血大鼠神经损伤

目的探讨大鼠神经生长因子(rat nerve growth factor,RtNGF)联合骨髓间充质干细胞-源外泌体(BMSCs exosomes)缓解脑出血(intracerebral haemorrhage,ICH)大鼠神经损伤的疗效及其作用机制。方法制备BMSCs exosomes。60只大鼠随机分为假手术(Sham)组,ICH组,ICH+RtNGF组,ICH+BMSCs exosomes组,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组,每组12只。建立ICH大鼠模型,并给予RtNGF或BMSCs exosomes单独治疗或联合治疗。制备各分组大鼠脑组织石蜡组织切片,并对其进行HE染色。qPCR法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子mRNA的相对表达水平。免疫组化(IHC)法测定各分组大鼠脑组织中Keap1/NQO1/Nrf2信号通路蛋白质因子的表达水平。结果与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中存在多处明显的组织腔隙和血凝块。ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组均有所改善,且ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组缓解神经损伤效果最好。与Sham组相比,ICH组大鼠脑组织中Keap1,NQO1和Nrf2 mRNA表达水平升高(P<0.05);上述3种蛋白质IHC相对染色评分升高(P<0.05)。与ICH组相比,ICH+RtNGF组、ICH+BMSCs exosomes组和ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平降低(P<0.05),且与ICH+RtNGF组或ICH+BMSCs exosomes组相比,ICH+RtNGF+BMSCs exosomes组上述检测指标水平更低(P<0.05)。结论RtNGF联合BMSCs exosomes治疗ICH大鼠,可通过Keap1/NQO1/Nrf2信号通路降低氧化应激缓解神经损伤。

金合欢素通过调节Sirt1介导的AMPK/Nrf2信号通路改善肺炎链球菌感染引起的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨金合欢素通过调节沉默信息调节因子相关酶1(Sirt1)介导的5'-磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路对肺炎链球菌(SP)感染引起的肺泡上皮细胞损伤的影响。方法:SP感染体外培养的肺泡上皮细胞A549建立细胞损伤模型,采用终浓度分别为0、5、25、50、100、150、200μmol/L的金合欢素处理,CCK-8检测各处理组细胞活力并筛选金合欢素最佳作用浓度。体外培养的A549细胞随机分为5组:对照组、模型组、金合欢素(150μmol/L)组、EX527(Sirt1抑制剂,40μmol/L)组、金合欢素(150μmol/L)+EX527组(40μmol/L),对照组不进行处理,其余各组以SP感染建立细胞损伤模型,150μmol/L金合欢素和40μmol/L EX527分别处理,CCK-8、流式细胞术分别检测各组细胞活力与凋亡率;试剂盒检测各组细胞活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平及IL-10、IL-1β、TNF-α水平;免疫印迹法检测各组细胞增殖相关蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡相关蛋白caspase-9、Bax表达、Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白p-AMPK/AMPK、Nrf2表达。结果:与对照组比较,模型组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS水平、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较,金合欢素组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达均升高(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS、IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05);EX527组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)。结论:金合欢素可通过上调Sirt1表达激活AMPK/Nrf2信号,进而促进抗炎因子分泌,减少ROS和促炎因子产生,减轻炎症与氧化应激,最终缓解神经元损伤。

金丝桃素通过调控AMPK/Nrf2/HO-1信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的:探讨金丝桃素(hypericin,Hyp)对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)大鼠心脏的影响及其作用机制。方法:30只SPF级雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(sham组)、心肌缺血再灌注损伤组(MIRI组)、金丝桃素低剂量给药组(MIRI+L-Hyp组)、金丝桃素高剂量给药组(MIRI+H-Hyp组)以及阳性对照药物曲美他嗪(trimetazidine,TMZ)给药组(MIRI+TMZ组),每组6只。除假手术组,其余4组大鼠均采用结扎左冠状动脉前降支后再通法建立MIRI模型,通过监测心电图判断造模是否成功;利用超声心动图检测大鼠心功能;TTC染色检测大鼠心肌梗死面积;HE染色观察大鼠心肌形态学特征;应用生化试剂盒分别测定大鼠血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量;应用ELISA试剂盒分别检测大鼠血清中心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I,cTnI)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;Western blot测定大鼠心肌组织中腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)以及血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达水平。结果:与sham组相比,MIRI组大鼠心肌组织病理损伤加剧,心肌梗死面积增大,超声心动图显示左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)降低,LDH活性、cTnI、MDA以及ROS含量均升高,SOD活性、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达均显著降低(P<0.05);与MIRI组相比,金丝桃素低、高剂量给药组及阳性对照药物曲美他嗪组大鼠心肌组织病理损伤减轻及心肌组织梗死面积减少,LVEF及LVFS升高,血清中LDH活性、cTnI、MDA以及ROS含量降低,而SOD活性、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表达均升高(P<0.05)。结论:金丝桃素可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,可能通过调节AMPK/Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。

基于Nrf2/HO-1/NQO1信号通路探讨雷公藤内酯三醇对急性肝损伤大鼠的保护机制

目的:基于核因子E2相关因子2/血红素氧合酶/醌氧化还原酶1(Nrf2/HO-1/NQO1)信号通路探究雷公藤内酯三醇对四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤大鼠的保护机制。方法:纳入40只SPF级雄性SD大鼠,适应性饲养7 d,而后随机分为4组(正常组、模型组及低剂量组、高剂量组),每组10只。正常组及模型组每日尾静脉注射等体积无菌0.9%氯化钠溶液,低剂量组、高剂量组分别注射100 mg/kg、200 mg/kg雷公藤内酯三醇,均连续注射7 d,于第7天注射雷公藤内酯三醇(模型组为无菌生理盐水)3 h后,对模型组、低剂量组、高剂量组大鼠腹腔注射1 mL/kg CCl4以进行急性肝损伤模型诱导(正常组腹腔注射等体积的橄榄油溶液)。在注射CCl416 h后取大鼠血液及肝脏标本,采用HE组织化学染色法观察大鼠肝组织切片的病理学改变,并检测4组血清肝功能指标水平及肝组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平及mRNA表达量。结果:肝组织病理检查结果显示,正常组肝组织细胞排列整齐,组织结构及形态正常,细胞界限明显,胞质完整。模型组在注射CCl416 h后,肝组织出现肝细胞边界不清晰、细胞排列紊乱等肝细胞坏死特征,且可见炎症细胞浸润及肝细胞严重水肿呈气泡样变。相比于模型组,低剂量组、高剂量组的肝细胞水肿程度及肝细胞坏死特征较轻,且高剂量组轻于低剂量组。模型组、低剂量组及高剂量组的肝指数大于正常组,血清天冬氨酸转氨酶(AST)、甲氨酸转氨酶(ALT)水平高于正常组(P<0.05);模型组肝指数大于低剂量组及高剂量组,且低剂量组大于高剂量组(P<0.05);模型组AST、ALT水平高于低剂量组及高剂量组,且低剂量组高于高剂量组(P<0.05)。模型组、低剂量组及高剂量组的肝组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平及Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达量高于正常组,且模型组高于低剂量组及高剂量组,低剂量组高于高剂量组(P<0.05)。结论:雷公藤内酯三醇可减轻CCl4诱导的大鼠急性肝损伤,其作用机制可能与其能激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路以抑制肝细胞氧化损伤有关。

西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路调控结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的作用机制研究

目的研究西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路对结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的调控作用。方法使用细胞计数试剂盒(CCK8)确定西黄胶囊和西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞活力的影响。使用流式细胞术、划痕法和侵袭小室法检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞凋亡、迁移以及侵袭的影响。使用蛋白质印迹技术检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞B细胞淋巴瘤2(BCL2)、BCL2关联X蛋白(BAX)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、锌指蛋白232(ZNF320)、血管内皮生长因子A(VEGA)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、核因子E2相关因子2(NRF2)和血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果CCK8实验结果显示,西黄胶囊和西妥昔单抗对HCT-116细胞活力最佳抑制时间是72 h,IC 50分别为5.28%和170.20 mg/L。与对照组相比,西黄胶囊和西妥昔单抗增加HCT-116细胞的凋亡(P<0.05)、抑制HCT-116细胞迁移以及侵袭(P<0.05)。与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗对HCT-116细胞的促凋亡效果和对迁移以及侵袭的抑制效果更加明显(P<0.05)。蛋白质印迹技术结果显示,与对照组比较,西黄胶囊和西妥昔单抗促进HCT-116细胞的BAX表达(P<0.05),抑制BCL2、MMP2、MMP9、ZNF320、VEGA、GSK3B、NRF2、HO-1的表达(P<0.05)。此外,与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗的效果更加明显(P<0.05)。结论西黄胶囊联合西妥昔单抗可能通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制结直肠癌HCT-116细胞的活力、迁移以及侵袭,促进细胞凋亡,且西黄胶囊联合西妥昔单抗的干预效果优于单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗。

金雀异黄酮通过Nrf2/HO-1信号通路减轻皮质神经元低氧/复氧损伤

目的研究金雀异黄酮(GEN)对皮质神经元低氧/复氧(H/R)损伤的影响,并基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路探讨其机制。方法分离并体外培养C57BL/6J小鼠胎鼠(妊娠15 d)皮质神经元,设正常对照(Normal)组、模型(H/R)组、GEN(12.5μmol·L^(-1))组、TBHQ(Nrf2激动剂,10μmol·L^(-1))组、GEN(12.5μmol·L^(-1))+TBHQ(10μmol·L^(-1))组。除正常对照组外,其他组采用低氧(5%CO_(2)+95%N_(2))4 h后复氧(5%CO_(2)+95%空气)24 h的方法制备H/R损伤皮质神经元模型,各组分别于造模前2h给药干预。采用CCK-8法、流式细胞术检测神经元活力和凋亡率,DCFH-DA荧光探针法检测神经元活性氧(ROS)含量,分光光度法检测神经元中丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活性,RT-PCR法检测神经元Nrf2、HO-1 mRNA表达,Western blot法检测神经元Nrf2、HO-1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与H/R组比较,GEN组、TBHQ组和GEN+TBHQ组皮质神经元活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);神经元中ROS、MDA含量明显降低,SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达量明显降低(P<0.05)。GEN+TBHQ组对H/R损伤皮质神经元活力、凋亡率、氧化应激指标、Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达的调控作用均明显优于GEN组和TBHQ组(P<0.05)。结论GEN可通过促进Nrf2/HO-1信号通路活化抑制氧化应激损伤和神经元凋亡,对皮质神经元H/R损伤起到保护作用。

益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的观察益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨其治疗CNP作用机制。方法采用去势结合雌激素诱导法制备CNP大鼠模型。48只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、塞来昔布组和益气活血托毒方组,每组12只。塞来昔布组予塞来昔布混悬液0.035 g/kg灌胃,益气活血托毒方组予益气活血托毒方水煎剂8.64 g/kg灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续28 d。Von Frey纤维丝测痛仪测定大鼠机械痛阈值,HE染色观察前列腺组织病理变化并进行病理评分,化学荧光法检测前列腺组织活性氧(ROS)含量,比色法测定前列腺组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,Western blot检测前列腺组织Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠机械痛阈值、前列腺指数显著降低(P<0.01);前列腺组织腺腔大小不一,腔内分泌物消失,间质疏松、水肿,有大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,病理评分显著升高(P<0.01);前列腺组织ROS、MDA含量显著升高,GSH-Px活性显著降低(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著降低,HO-1蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,益气活血托毒方组大鼠机械痛阈值显著升高(P<0.01);前列腺组织轻微损伤,有少量纤维增生和炎性细胞浸润,病理评分显著降低(P<0.01,P<0.05);前列腺组织ROS、MDA含量显著降低,GSH-Px活性显著升高(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著升高,HO-1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论益气活血托毒方可有效改善CNP大鼠前列腺组织病理形态,提高痛阈值,其作用机制可能与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,降低大鼠前列腺组织氧化应激损伤有关。

基于Keap1/Nrf2/HO-1信号通路研究当归醇提物对多囊卵巢综合征大鼠的保护作用

目的使用来曲唑联合高脂饮食建立多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)大鼠模型,探讨当归醇提物(ethanol extract of Angelicae Sinensis Radix,EEA)对PCOS大鼠的保护作用及其作用机制。方法来曲唑联合高脂饮食诱导雌性SD大鼠建立PCOS模型,并用EEA干预。阴道涂片染色、HE染色、酶联免疫吸附法(ELISA)和生化指标检测评价EEA对PCOS大鼠的治疗作用,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测EEA对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响。结果阴道涂片和HE染色结果表明,EEA改善了PCOS大鼠动情周期紊乱和卵巢组织病变,ELISA和生化指标检测结果表明EEA可以调节激素紊乱,改善血脂异常;且在模型组中Keap1蛋白和mRNA表达明显上调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显下调而经过EEA治疗后Keap1蛋白和mRNA表达明显下调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论EEA可以减轻大鼠PCOS,其机制可能是通过促进Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,从而抑制氧化应激。

冰菖散通过Nrf2/HO-1信号通路改善APP/PS1阿尔茨海默病小鼠铁死亡及认知功能障碍的研究

目的探讨吸嗅冰菖散通过调节Nrf2/HO-1信号通路来改善阿尔茨海默病(AD)小鼠的铁死亡和认知功能障碍。方法30只APP/PS1小鼠随机分为模型组(APP/PS1组)、冰菖散低剂量组(BCS-L组)和冰菖散高剂量组(BCS-H组),10只同窝阴性小鼠作为空白组(WT组)。WT组和APP/PS1组进行纯水雾化给药处理;BCS-L组和BCS-H组每日雾化给药0.5、1μL冰菖散吸嗅剂,每日10 min,持续2周。给药2周后进行水迷宫实验来判断各组小鼠空间认知能力,水迷宫实验后处死小鼠,取大脑组织进行Aβ_(1-42)免疫荧光和磷酸化Tau蛋白(P-tau)免疫组化及尼氏染色;提取海马组织进行Western blot、qPCR检测Keap1、Nrf2、HO-1、GPX4、SCL7A11、TFRC、DMT1、FTL、FTH1的蛋白和mRNA表达水平;提取大脑组织进行GSH试剂盒检测。结果BCS各组逃避潜伏期缩短,平台所在象限活动时间和穿越平台次数增加。相对于APP/PS1组,BCS各组小鼠的海马CA1区和皮层中的Aβ_(1-42)和P-tau表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。尼氏染色显示,BCS各组神经元排列较为紧密,有较多尼氏体。在海马组织中,相比于未处理的APP/PS1小鼠,BCS各组在Nrf2、HO-1、SLC7A11、GPX4、FTL的蛋白和mRNA表达水平上均有显著提升(P<0.05,P<0.01),BCS-L组FTH1的蛋白和mRNA水平有提升,但无显著意义,同时TFRC、DMT1、Keap1的表达水平显著下调(P<0.05,P<0.01)。此外,BCS各组能有效恢复其大脑中GSH的含量(P<0.05,P<0.01)。结论吸嗅BCS可以改善APP/PS1小鼠认知功能障碍。BCS可以激活Nrf2/HO-1通路,增加GPX4的表达,并通过抑制Keap1来增强Nrf2的转录活性,从而提高SLC7A11的表达并恢复GSH的含量,有效对抗铁死亡。同时,冰菖散还能有效抑制TFRC和DMT1,上调FTL和FTH1的表达,进而维持细胞内铁的稳态平衡,有助于减轻铁死亡对APP/PS1小鼠的影响,可改善AD小鼠的认知功能。

基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨高良姜总黄酮对铅诱导HK-2细胞损伤的保护作用

目的 探讨高良姜总黄酮对铅(Pb)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞损伤的保护作用。方法 体外培养HK-2细胞,MTT法检测不同质量浓度高良姜总黄酮和Pb对HK-2细胞活力的影响。设置对照组、高良姜总黄酮对照组、模型组和高良姜总黄酮组,除对照组和高良姜总黄酮对照组外各组均给予200μmol/L Pb诱导细胞损伤,同时高良姜总黄酮对照组和高良姜总黄酮组给予100μg/mL高良姜总黄酮干预24 h。通过Hoechst 33258荧光染色法联合annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜法观察Pb诱导及高良姜总黄酮干预对细胞内ROS水平的影响,试剂盒法检测细胞内氧化应激指标ROS、MDA、GSH水平和GSH-Px、CAT、SOD活性,ELISA法检测细胞培养上清液IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western bolt法检测细胞Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达。结果 与对照组比较,高良姜总黄酮(12.5~200μg/mL)对HK-2细胞活力没有显著影响。与模型组比较,高良姜总黄酮可减少Pb诱导HK-2细胞的凋亡(P<0.05),减轻细胞皱缩等细胞凋亡形态学变化,上调细胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平(P<0.05),降低细胞内MDA、ROS水平(P<0.05),上调Keap1/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白及caspase-3蛋白表达(P<0.05)。结论 高良姜总黄酮可能通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白表达,对Pb诱导HK-2细胞损伤起保护作用。

藤黄健骨胶囊通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路抑制绝经后骨质疏松大鼠成骨细胞凋亡

藤黄健骨胶囊可以提高绝经后骨质疏松模型鼠的骨密度来改善其骨微结构损害,但具体机制尚未阐明。本文主要研究藤黄健骨胶囊抑制绝经后骨质疏松症大鼠成骨细胞凋亡与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路的关系,旨在探讨藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松症的作用机制。采用去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠模型,分别给予藤黄健骨胶囊(0.09、0.18、0.36 g/kg)灌胃,连续干预8周后进行指标检测。采用TUNEL染色观察股骨组织凋亡情况,结果发现,藤黄健骨胶囊各剂量组股骨组织凋亡阳性细胞和凋亡率均减少(P<0.01)。采用双重免疫荧光染色观察股骨组织成骨细胞中SIRT1、PGC-1α和Nrf2表达水平表达情况,结果发现,藤黄健骨胶囊中、高剂量组成骨细胞PGC-1α表达荧光面积明显升高,各剂量组成骨细胞SIRT1和Nrf2表达荧光面积也明显升高(P<0.01)。qPCR和Western印迹检测股骨组织SIRT1、PGC-1α、Nrf2、Runx2、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平和翻译水平变化,结果显示,藤黄健骨胶囊中、高剂量组股骨组织Runx2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2蛋白质水平均明显升高,Caspase-9蛋白质水平明显下降,各剂量组股骨组织SIRT1、PGC-1α、Bcl-2 mRNA水平和蛋白质水平、Nrf2 mRNA水平也均明显升高,而其各剂量组股骨组织Caspase-3mRNA水平、蛋白质水平和Caspase-9 mRNA水平均则明显降低(P<0.01)。综上,本研究初步揭示了藤黄健骨胶囊对绝经后骨质疏松模型鼠成骨细胞凋亡的抑制与SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路有关,SIRT1可能是调控成骨细胞凋亡的重要靶点。

丹参多酚酸盐调控Nrf2/HO-1信号通路对膜性肾病大鼠氧化应激的影响

[目的]基于血清核转录因子2(Nrf2)/血红蛋白氧合酶-1(HO-1)信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病(MN)大鼠氧化应激的影响。[方法] 80只SD雄性大鼠随机选取20只为正常对照组,其余60只大鼠均采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)构建MN模型,MN模型大鼠复制成功后随机分为模型组,盐酸贝那普利组(10 mg/kg),丹参多酚酸盐分为低、中、高剂量组(16.7、33.3、66.7 mg/kg)。药物灌胃连续4周,1次/d,正常组和模型组予以相等体积的生理盐水灌胃。治疗后检测大鼠24 h尿蛋白定量(24 h UTP)。给药结束后,经大鼠腹主动脉取血检测血尿素氮(BUN),血清肌酐(Scr),三酰甘油(TG),总胆固醇(TC),总蛋白(TP),白蛋白(ALB)水平;过碘酸-六胺银(PASM)染色观察大鼠肾组织病理形态;免疫荧光检测肾组织免疫球蛋白G(IgG)、补体C3沉积情况;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表达情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)观察肾组织Nrf2、HO-1蛋白及Nrf2、HO-1 mRNA表达。[结果]与正常组相比,模型组大鼠肾小球出现体积增大、基底膜增厚、“钉突”形成,沿毛细血管襻有补体C3、IgG弥漫性沉积,24 h UTP、血清TG、TC水平显著升高(P<0.01),TP、ALB水平显著降低(P<0.01),BUN、SCr差异无统计学意义;血清中SOD表达显著降低(P<0.01),MDA表达显著升高(P<0.01);肾组织Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组相比,各治疗组大鼠24 h UTP、血清TG、TC水平显著降低(P<0.05或P<0.01),TP、ALB水平显著升高(P<0.01),但丹参多酚酸盐低剂量组改善不明显;各治疗组肾脏病理损害明显改善;SOD表达水平显著升高(P<0.01),MDA表达水平明显降低(P<0.01);Nrf2、HO-1mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。[结论]丹参多酚酸盐可能通过调控Nrf2/HO-1信号通路,缓解肾组织氧化应激,进而保护肾脏及延缓疾病进展。

黄芪甲苷调控Nrf2/HO-1信号通路对血管内皮细胞氧化损伤的影响

目的 基于细胞实验研究黄芪甲苷(astragalosideⅣ,AST-Ⅳ)调控核转录因子红系2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1,Nrf2/HO-1)信号通路对血管内皮氧化损伤的影响。方法 采用1-棕榈酰基-2-(5'-氧-戊酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱[1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphocholine,POVPC]刺激血管内皮细胞24 h建立血管内皮细胞氧化损伤模型,随机分为模型(Model)组(35μmol/L POVPC)、AST-Ⅳ低剂量(AST-L)组(35μmol/L POVPC+50μmol/L AST-Ⅳ)、AST-Ⅳ高剂量(AST-H)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ)及AST-Ⅳ高剂量+ML385(Nrf2抑制剂)(AST-H+ML385)组(35μmol/L POVPC+100μmol/L AST-Ⅳ+5μmol/L ML385),以正常未处理细胞作为对照(Control)组。免疫荧光鉴定大鼠胸主动脉内皮细胞(aortic vascular endothelium cell,AVEC),CCK-8检测AST-Ⅳ细胞增殖情况,Transwell小室检测AVEC迁移情况,Matrigel基质胶检测细胞血管形成功能,鬼笔环肽染色检测细胞骨架结构,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒法检测细胞培养上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,RT-qPCR和Western blot检测Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达情况。结果 免疫荧光鉴定所提取的细胞,可特异性表达血管性血友病因子(von willebrand factor,v WF),鉴定为AVEC。与Control组相比,Model组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏明显,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的m RNA及蛋白表达水平下调(P<0.01或P<0.05)。与Model组比较,AST-L组及AST-H组细胞活力、迁移能力和血管形成功能显著升高(P<0.01),细胞骨架破坏得到较好修复,细胞内ROS水平显著下降(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著增加(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著上调(P<0.01),且以AST-H组效果更为显著(P<0.01)。与AST-H组比较,ASTH+ML385组迁移能力和血管形成功能显著下降(P<0.01),细胞骨架破坏增加,细胞内ROS水平显著上升(P<0.01),细胞培养上清液中SOD含量显著减少(P<0.01),细胞中Nrf2和HO-1的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。结论 AST对血管内皮氧化损伤具有保护作用,且有一定的剂量依赖性,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1信号通路发挥作用。

肠道菌群代谢产物氧化三甲胺通过抑制Keap1/Nrf2信号通路激活发挥促动脉粥样硬化作用

目的:研究肠道菌群(GM)代谢产物氧化三甲胺(TMAO)对动脉粥样硬化(AS)的影响及其相关机制。方法:按照随机数字表法将雄性小鼠分为对照组、模型组、TMAO组、Keap1/Nrf2激动剂RTA-408组和TMAO+RTA-408组,每组12只。其中,模型组小鼠采用高脂饲料喂养,TMAO组小鼠在高脂饲料中加1%胆碱,造模周期为12周。造模结束后,RTA-408组和TMAO+RTA-408组小鼠每天腹腔单次注射RTA-408(100μg/kg),持续给药14d,期间其他各组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。采用生化分析法定量测定TG、TC、LDL-C和HDL-C的水平。通过HE、Masson三色和油红O染色检测主动脉的组织学改变。通过ELISA检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平。超高液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)检测小鼠血浆中TMAO含量;荧光探针法检测主动脉ROS的荧光强度;qRT-PCR、Western blot分别检测小鼠主动脉组织中Keap1、Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平;免疫荧光观察Nrf2的核易位情况。结果:AS小鼠血清TC、TG、LDL-C浓度相较于对照组升高,HDL-C浓度则降低(P<0.01)。此外,模型组显示广泛的主动脉内膜增厚,明显的泡沫细胞形成,动脉壁胶原沉积增加。此外,血清中IL-1β、ROS和TMAO水平显著升高(P<0.01),SOD活性显著降低(P<0.01),主动脉中ROS含量增加、Nrf2核转位显著抑制(P<0.01),Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA与蛋白表达水平升高(P<0.01)。与AS小鼠相比,TMAO处理进一步加重对应指标上述变化趋势(P<0.05);RTA-408则取消TMAO对AS小鼠的加重作用(P<0.05)。结论:TMAO可能通过抑制Keap1/Nrf2信号通路激活对AS小鼠的主动脉病理改变、炎症反应和内皮损伤发挥加重作用。

虫草素通过激活Nrf2/HO-1/NQO1通路缓解脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤

目的探讨虫草素(cordycepin,COR)在脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion,CI/R)大鼠脑组织损伤中的保护作用及机制。方法60只Wistar大鼠分为健康对照组、模型组、模型加药组。跳台试验和Y迷宫实验检测大鼠学习和记忆力;HE染色法检测脑组织病理变化;干湿重法计算脑含水率和脑指数;TUNEL法观测脑组织细胞凋亡情况;ELISA测定大鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase。SOD)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量;蛋白质印迹检测Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平。结果与模型组比较,COR能剂量依赖地改善大脑组织损伤,抑制氧化应激,促进Nrf2/HO-1/NQO1通路激活。结论虫草素能够改善脑组织损伤,其作用机制与上调Nrf2通路有关。

基于Keap1/Nrf2信号通路探讨苗药痛风方对痛风性关节炎大鼠的作用机制

目的:探讨苗药痛风方(MTP)是否通过调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路,减轻痛风性关节炎模型大鼠氧化应激损伤。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、MTP组、Nrf2抑制剂全反式维甲酸(ATRA)组和MTP组+ATRA组。使用3%氧嗪酸钾溶液(10 mL/kg)行腹腔内注射,每天2次,连续注射1周,然后在大鼠右侧膝关节注射0.2 mL尿酸钠混悬液(25 g/L),构建痛风性关节炎模型。各组大鼠于造模后48 h处死取材,测量大鼠膝关节肿胀程度;HE染色观察大鼠膝关节病理改变;试剂盒检测大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和白细胞介素1β(IL-1β)水平;qRT-PCR法检测大鼠膝关节滑膜中Nrf2、Keap1、血红素加氧酶1(HO-1)、IL-1β和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)的mRNA表达;Western blot检测大鼠膝关节滑膜中Nrf2、Keap1和NQO1的蛋白表达。结果:与模型组相比,MTP能显著降低大鼠膝关节肿胀程度,减轻膝关节滑膜的病理损伤,抑制MDA和IL-1β的表达,增加SOD的表达,上调滑膜中HO-1 mRNA及Nrf2和NQO1 mRNA和蛋白的表达,下调IL-1βmRNA及Keap1 mRNA和蛋白的表达。结论:MTP通过调控Nrf2及其下游抗氧化基因发挥防治大鼠痛风性关节炎的作用。

基于Nrf2/HO-1信号通路探讨穴位埋线抑制脾肾阳虚夹瘀型溃疡性结肠炎大鼠氧化应激损伤作用机制

目的观察穴位埋线对脾肾阳虚夹瘀型溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达的影响,探讨穴位埋线治疗UC的可能机制。方法SPF级SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶(SASP)组和穴位埋线组,每组10只。除空白组外,其余各组通过腺嘌呤、番泻叶分阶段灌胃联合冰水浴+2,4,6-三硝基苯磺酸与乙醇混合试剂灌肠建立脾肾阳虚夹瘀型UC大鼠模型。穴位埋线组选取双侧“足三里”“天枢”“肾俞”“脾俞”“大肠俞”“膈俞”穴位埋线治疗,7d/次,共2次,SASP组予柳氮磺吡啶混悬液灌胃,空白组和模型组予生理盐水灌胃,1次/d,连续14d。称量大鼠体质量、观察大便性状和便血情况;测量大鼠结肠长度,观察结肠黏膜损伤情况,对结肠黏膜损伤指数(CMDI)进行评分;HE染色观察结肠组织病理形态变化;生化法测定大鼠血清丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;RT-PCR和Westernblot分别检测结肠组织Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA和蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠体质量下降(P<0.01),结肠长度缩短(P<0.01),结肠黏膜形成明显溃疡面,隐窝结构丧失,腺体排列紊乱,大量炎性细胞浸润,CMDI评分升高(P<0.01),血清MDA含量增加,SOD、CAT、GSH-Px活性降低(P<0.01),结肠组织Keap1 mRNA和蛋白表达升高,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.01);与模型组比较,SASP组和穴位埋线组大鼠体质量增加(P<0.01),结肠长度增加(P<0.01),结肠黏膜病理损伤明显减轻,CMDI评分降低(P<0.01),血清MDA含量降低,SOD、CAT、GSH-Px活性升高(P<0.01),结肠组织Keap1mRNA和蛋白表达降低,Nrf2、HO-1mRNA和蛋白表达升高(P<0.01)。SASP组和穴位埋线组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论穴位埋线可减轻UC大鼠结肠黏膜病理损伤,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制氧化应激反应有关。

基于Nrf2/HO-1和NF-κB信号通路探讨羟基酪醇对环磷酰胺诱导的卵巢储备功能不足小鼠的影响

目的探讨羟基酪醇(HT)对环磷酰胺(CTX)诱导的卵巢储备功能不足(DOR)小鼠卵巢损伤的影响及其改善DOR小鼠卵巢功能的作用机制。方法将40只7~8周龄的雌性C57BL/6L小鼠随机分为对照组、模型组(CTX组)、HT低剂量实验组(CTX+L-HT组,50 mg·kg^(-1)·d^(-1))以及HT高剂量实验组(CTX+H-HT组,100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只。腹腔注射CTX(50 mg·kg^(-1)·d^(-1))建立DOR小鼠模型,采用HE染色观察小鼠卵巢组织形态学变化及各级卵泡数量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中性激素、氧化应激因子指标和炎性因子指标,通过Western blot检测卵巢组织中Nrf2、HO-1、p-NF-κB以及NF-κB蛋白表达水平。结果与对照组相比,CTX组各级卵泡数量显著减少,而闭锁卵泡数量显著增加(P<0.05),颗粒细胞层减少,黄体减少,血清中FSH、LH的水平显著升高(P<0.05),雌二醇(E_(2))和抗苗勒管激素(AMH)的水平显著降低(P<0.05);CTX组卵巢组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均显著降低(P<0.05),而丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.05),卵巢组织中促炎因子水平(TNF-α、IL-6及IL-1β)显著增加(P<0.05),而抗炎因子(IL-10)水平显著减少(P<0.05),卵巢组织中Nrf2和HO-1蛋白表达量显著减少(P<0.05),而p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平比率显著增加(P<0.05)。与CTX组相比,CTX+L-HT组和CTX+H-HT组各级卵泡数目均显著增加(P<0.05),而闭锁卵泡数目均显著减少(P<0.05),小鼠血清中FSH、LH水平均显著减少(P<0.05),而E_(2)和AMH水平均显著增加(P<0.05);其次,CTX+L-HT组和CTX+H-HT组卵巢组织中SOD、CAT以及GSH-Px活性均显著增加(P<0.05),MDA含量显著减少(P<0.05),卵巢组织中促炎因子水平显著减少(P<0.05),而抗炎因子水平显著增加(P<0.05),小鼠卵巢组织中Nrf2和HO-1蛋白表达量均显著增加(P<0.05),而p-NF-κB/NF-κB蛋白表达水平比率均显著减少(P<0.05)。与CTX+L-HT组相比,CTX+H-HT组IL-10水平显著增加(P<0.05)。结论羟基酪醇对DOR小鼠卵巢损伤具有保护功能,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制NF-κB信号通路以及减少氧化应激和炎症反应有关。