青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

竹节参总皂苷调控AMPK/mTOR/ULK1通路介导的铁自噬对糖尿病心肌病大鼠心肌细胞铁死亡的抑制作用

目的探究竹节参总皂苷(TSPJ)对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌细胞铁死亡的作用及调控机制。方法实验1:将SD大鼠分为对照组、DCM组、TSPJ低剂量组、TSPJ高剂量组、二甲双胍组(Met),每组各10只。实验2:将SD大鼠分为对照组、DCM组、TSPJ组、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂Compound C组、TSPJ+AMPK激动剂AICAR组,每组各10只。除对照组外,其余各组大鼠均采取腹腔注射链脲佐菌素构建DCM模型。各组大鼠给予对应药物干预8周后,检测各组大鼠体重及糖脂代谢水平;超声心动图检测大鼠心功能指标;酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)水平;苏木精-伊红(HE)染色和电镜观察心肌组织病理变化;试剂盒检测心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、丙二醛、活性氧簇(ROS)及Fe2+水平;Western印迹法检测心肌组织铁死亡、铁自噬以及AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/UNC-51样激酶1(mTOR/ULK1)信号通路相关蛋白表达。结果与对照组相比,DCM组大鼠左心室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)、舒张早期与晚期血流速度峰值比值(E/A)均显著降低,舒张末期左心室内径(LVEDd)增加,血清LDH、cTnI、CK-MB升高,心肌组织SOD、GSH降低,丙二醛、ROS和Fe2+增加,转铁蛋白受体1(TFR1)、核受体共激活因子4(NCOA4)、LC3-II/LC3-I、Beclin-1、磷酸化AMPK及磷酸化ULK1表达水平升高,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、磷酸化mTOR表达水平降低。与DCM组相比,各治疗组大鼠上述指标均得到显著改善。与TSPJ组相比,AMPK激动剂AICAR能够逆转TSPJ对DCM大鼠心肌细胞铁死亡及AMPK/mTOR/ULK1通路介导的铁自噬作用。结论 TSPJ能够通过调控AMPK/mTOR/ULK1介导的铁自噬抑制DCM大鼠心肌细胞铁死亡,改善心肌损伤。

龟鹿二仙胶对IL-1β诱导的AMPK/mTOR/ULK1通路介导的体外培养软骨细胞自噬的影响

目的探讨龟鹿二仙胶对IL-1β诱导的AMPK/mTOR/ULK1通路介导的体外培养软骨细胞自噬的影响。方法采用酶消法体外培养野生型小鼠和mTOR-KO小鼠软骨细胞。将软骨细胞分为空白组、模型组、龟鹿组、CKO组和龟鹿+CKO组。干预24h后,采用CCK-8法检测各组软骨细胞活性;TUNEL法检测各组软骨细胞凋亡情;激光共聚焦显微镜观察各组软骨细胞LC3B蛋白表达;Western blotting和qRT-PCR检测mTOR、ULK1、AMPK、LC3B、ATG5、PARP-1蛋白及mRNA的表达。结果与空白组比较,模型组软骨细胞活性显著下降(P<0.01),凋亡率显著升高(P<0.01),LC3B光强度显著降低(P<0.01),mTOR、PARP1蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),ULK1、AMPK、Atg5、LC3B蛋白及mRNA表达降低(P<0.05);与模型组相比,龟鹿组软骨细胞活性显著提升(P<0.01),凋亡率显著下降(P<0.01),LC3B光强度显著升高(P<0.01),ULK1、AMPK、Atg5、LC3B蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),mTOR、PARP1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05);与龟鹿组相比,CKO组及龟鹿+CKO组软骨细胞活性显著提升(P<0.01),凋亡率显著下降(P<0.01),LC3B光强度显著升高(P<0.01,P<0.05),mTOR、PARP1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),ULK1、AMPK、Atg5、LC3B蛋白及mRNA表达升高(P<0.05);与CKO组相比,龟鹿+CKO组软骨细胞活性显著提升(P<0.01),凋亡率显著下降(P<0.05),LC3B光强度显著升高(P<0.05),ULK1、AMPK、Atg5、LC3B蛋白及mRNA表达升高(P<0.05),PARP1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),mTOR蛋白及mRNA表达降低,差异无统计学意义(P>0.05)。结论龟鹿二仙胶可通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路发生自噬,促进退变软骨细胞的增殖,进而减少软骨细胞凋亡。

银杏内酯K调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨银杏内酯K(GK)调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法 取对数生长期的MCF-7细胞,设置分组为对照组、GK低浓度(GK-L,12.5μg/mL)组、GK中浓度(GK-M,25μg/mL)组、GK高浓度(GK-H,50μg/mL)组、GK-H+AMPK抑制剂(Compound C,50μg/mL GK+50μmol/L Compound C)组。观察各组细胞形态以及细胞增殖、凋亡、自噬状况并分析自噬相关基因LC3、P62、Beclin1 mRNA表达以及AMPK、p-mTOR、mTOR、p-ULK1、ULK1、LC3、P62、Beclin1表达。结果 与对照组相比,GK-L、GK-M、GK-H组细胞自噬泡数量增多,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62表达显著下降,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著增加(P<0.05);与GK-H组相比,GK-H+Compound C组细胞自噬泡数量减少,增殖率、p-mTOR/mTOR、p-ULK1/ULK1、p62显著增加,凋亡率、LC3、Beclin1表达、AMPK蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 GK可以诱导乳腺癌细胞自噬和凋亡、抑制其增殖,可能与激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有关。

阿江榄仁酸由AMPK/mTOR/HO-1信号通路调控自噬对糖尿病视网膜病变影响

目的探讨阿江榄仁酸(arjunolic acid,AA)对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜细胞自噬及AMPK/mTOR/HO-1信号通路的影响。方法以健康SD大鼠为研究对象,构建链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,随机分为对照组(Con)组、模型(STZ)组、AA低剂量(AAL,10 mg/kg)组和AA高剂量(AAH,10 mg/kg)组。连续给药10周后,HE染色检测视网膜组织病理结构;qRT-PCR检测视网膜组织白介素(IL)-1β、IL-6和线粒体丙酮酸转运载体(MPC)-1的mRNA表达;二氢乙锭(DHE)染色评估视网膜组织ROS产生;Western blot检测自噬和AMPK/mTOR/HO-1信号通路相关蛋白表达。结果与Con组比较,STZ组大鼠视网膜出现肿胀和空泡样变化等病理变化,中央视网膜ONL层厚度和细胞核计数明显降低(P<0.01);IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA水平显著增高(P<0.05);视网膜外核层(ONL)、内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)中ROS产生增加(P<0.01);LC3II/I比率、HO-1和p-AMPK/AMPK蛋白表达显著降低,p62和p-mTOR/mTOR表达升高(P<0.01)。与STZ组比较,AAL和AAH组大鼠视网膜ONL厚度和细胞核计数逐渐升高,结构相对规整(P<0.05);AAH组IL-1β、IL-6和MCP-1的mRNA表达明显降低(P<0.05);视网膜ONL、INL和GCL中ROS产生逐渐降低(P<0.01);LC3II/I比率、p-AMPK/AMPK和HO-1表达逐渐升高,p62和p-mTOR/mTOR表达逐渐降低(P<0.01)。结论阿江榄仁酸可能是治疗DR的候选药物,可能机制为通过AMPK/mTOR/HO-1调节的自噬途径保护视网膜细胞免受STZ诱导的氧化应激和炎症损伤。

金丝桃苷通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾病综合征大鼠自噬反应的影响

目的探究金丝桃苷(Hyp)对肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)大鼠肾自噬及AMPK/mTOR/ULK1通路的影响。方法32只6周龄SD大鼠分为正常组(N组)、肾病综合征组(NS组)、金丝桃苷组(Hyp组,60 mg/kg Hyp)、金丝桃苷+AMPK抑制剂组(Hyp+CC组,60 mg/kg Hyp+0.2 mg/kg CC),每组8只。除N组外,其余各组大鼠采用一次性尾静脉注射阿霉素(6.5 mg/kg)建立NS模型,模型成功率为75.0%。Hyp组大鼠灌胃给予60 mg/kg的Hyp,Hyp+CC组给予60 mg/kg的Hyp灌胃和0.2 mg/kg CC腹腔注射,N组和NS组给予等量溶剂,每天1次,连续14 d。给药结束后,全自动分析仪检测24 h尿液总蛋白(UTP)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)和白蛋白(ALB)水平;HE染色观察肾组织病理形态;透射电子显微镜(TEM)观察肾组织超微结构变化;Western blot检测肾中自噬、足细胞及AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白表达;免疫荧光染色观察自噬体和足细胞的定位。结果相比于N组,NS组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚;UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。相比于NS组,Hyp治疗可改善肾小球形态,降低UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值(P<0.05),增加ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值(P<0.05)。相比于Hyp组,Hyp+CC组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚;UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。结论Hyp可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1通路促进肾细胞自噬活性,减轻NS大鼠的足细胞损伤等肾病变。

温阳健脾方调节AMPK/mTOR/ULK1通路上调RSA小鼠孕期自噬水平改善其蜕膜化的机制研究

目的:探讨温阳健脾方通过影响AMPK/mTOR/ULK1信号轴调控RSA小鼠孕期自噬水平,从而对其蜕膜化影响的机制研究。方法:CBA/J雌鼠与BALB/c雄鼠合笼建立空白组10只,CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠合笼建立RSA小鼠模型,随机将其分为模型组、温阳健脾方中剂量组,10只/组;于妊娠第1天开始,温阳健脾方组予温阳健脾方13.96 g/(kg·d)灌胃,空白组及模型组予以等体积0.9%氯化钠溶液,连续干预14 d后眼球取血,取蜕膜组织,计算胚胎丢失率,ELISA测定各组小鼠血清中胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)和催乳素(PRL),HE染色观察小鼠子宫内膜形态,Western blot法测定小鼠蜕膜组织AMPK、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62表达。结果:与空白组相比,RSA模型组胚胎吸收率显著降低(P<0.01);血清中IGFBP-1、PRL降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量显著下调(P<0.001),p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量明显下降,mTOR、ULK1、p62蛋白表达水平显著上调(P<0.01);与模型组比较,温阳健脾方组胚胎吸收率明显降低(P<0.05);血清中IGFBP-1、PRL水平上升(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、Beclin1蛋白相对表达量均上调,mTOR、ULK1、p62蛋白相对表达量下调(P<0.05)。结论:温阳健脾方可通过AMPK/mTOR/ULK1通路促进RSA小鼠孕期自噬水平从而改善其蜕膜化,有效提高妊娠率。

DUSP1通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导BCG诱导的巨噬细胞自噬

目的探讨双特异性磷酸酶1(dual-specificity phosphatase-1,DUSP1)对卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染引起的THP-1巨噬细胞自噬的调控作用。方法利用小干扰RNA技术建立DUSP1干扰巨噬细胞模型,BCG感染细胞后,通过Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等技术检测DUSP1和自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1、ATG5、ATG7、ATG12以及自噬相关信号通路关键蛋白p-AMPK、p-ULK1、p-mTOR的表达水平。结果BCG感染巨噬细胞后,可显著上调DUSP1和LC3-II的表达水平,并呈时间梯度依赖性(P<0.001);与BCG单独感染组相比,si-DUSP1+BCG组自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1、ATG5、ATG7和ATG12的表达水平显著降低(P<0.001),自噬流减弱,同时,p-AMPK、p-ULK1的表达显著降低(P<0.001),而p-mTOR的表达水平则显著升高(P<0.001)。结论DUSP1可能通过AMPK/mTOR/ULK1通路促进BCG感染引起的细胞自噬。

基于AMPK/ULK1通路探讨鸢尾素对老年糖尿病肌少症大鼠肌保护作用及机制

目的 探讨鸢尾素调节AMPK/ULK1通路对老年糖尿病大鼠肌保护的作用及机制。方法随机选择10只大鼠作为对照组(CON组),40只大鼠通过链脲佐菌素(STZ)注射构建2型糖尿病(T2DM)模型。将造模成功的大鼠随机均分为模型组(Mod组)、鸢尾素组(30μg/kg)、Compound C组(0.2 mg/kg)、鸢尾素+Compound C组(30μg/kg+0.2 mg/kg),每组10只,每天一次给药,连续治疗4周。CON组和Mod组给予等量生理盐水注射。抓绳实验检测大鼠肢体肌肉力量;称量大鼠体重、腓肠肌重量,计算腓肠肌重量占体重百分比(腓/体);用血糖仪检测血糖水平;双抗体夹心法检测血清胰岛素水平;苏木精-伊红(HE)染色检测腓肠肌病理变化;Western blot检测自噬蛋白、AMPK/ULK1通路蛋白表达。结果 CON组大鼠肌细胞排列有序,无水肿坏死现象;Mod组大鼠肌细胞排列杂乱,出现细胞水肿、坏死以及炎性浸润现象,同时部分肌纤维出现溶解现象;鸢尾素组改善了以上现象,与CON组结构类似;Compound C组大鼠肌细胞水肿、坏死、炎性浸润现象加重,鸢尾素+Compound C组结构与Mod组相似;与CON组[(3.13±0.42)min、(0.53±0.06)ng/mL、(5.67±0.45)mmol/L、(0.13±0.01)%]相比,Mod组大鼠抓绳时间[(1.48±0.17)min]、体重、腓肠肌重量以及腓/体、胰岛素含量[(0.36±0.04)ng/mL]、Beclin1、LC3-II/I蛋白水平、p-AMPK/AMPK、ULK1蛋白水平显著下降(P<0.05),血糖[(23.68±1.98)mmol/L]、IRI[(0.38±0.04)%]显著升高(P<0.05);与Mod组相比,鸢尾素组大鼠抓绳时间[(2.89±0.31)min]、体重、腓肠肌重量以及腓/体、胰岛素含量[(0.50±0.07)ng/mL]、Beclin1、LC3-II/I蛋白水平、p-AMPK/AMPK、ULK1蛋白水平显著上升(P<0.05),血糖[(8.62±0.62)mmol/L]、IRI[(0.19±0.01)%]显著降低(P<0.05),而Compound C组[(0.51±0.05)min、(0.24±0.02)ng/mL、(48.43±2.23)mmol/L、(0.52±0.05)%]趋势与之相反,Compound C减弱了鸢尾素对老年糖尿病大鼠的肌保护作用。结论鸢尾素可能通过激活AMPK/ULK1通路起到对老年糖尿病大鼠肌保护的作用。

补阳还五汤通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控自噬减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤

目的探讨补阳还五汤抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路机制。方法用改良线栓法建造大鼠左侧脑缺血模型,各组大鼠每24 h给药1次,共3次。再灌注72 h后观察大鼠神经损伤情况和脑梗死体积改变;尼氏染色法和TUNEL染色法观察神经细胞形态、数量以及凋亡情况;Western blot检测自噬蛋白和AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路相关蛋白表达情况。结果补阳还五汤改善大鼠神经功能缺陷,减少脑梗死体积和神经细胞凋亡,减轻脑组织病理损伤;抑制AMPK磷酸化活化,解除AMPK对下游mTOR和ULK1的抑制,促进二者磷酸化激活,抑制细胞自噬。AMPK激动剂Metformin提高细胞自噬水平,同时逆转了补阳还五汤抗大鼠脑缺血/再灌注损伤作用。结论补阳还五汤介导AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路对脑缺血/再灌注损伤大鼠发挥神经保护作用。

绞股蓝总甙调控mTOR/ULK1通路对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响

目的 基于mTOR/ULK1自噬信号通路探讨绞股蓝总甙改善动脉粥样硬化模型小鼠主动脉脂质沉积的作用机制。方法 30只健康ApoE^（-/-）小鼠随机分为模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组,每组10只。10只C57BL/6J小鼠作为正常组。模型对照组、绞股蓝总甙组和辛伐他汀组采用高脂饲料喂养4周,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组分别采用绞股蓝总甙2.973 g/（kg·d）、辛伐他汀2.275 mg/（kg·d）灌胃8周,模型对照组、正常组予等量生理盐水灌胃。HE染色观察小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况,全自动生化分析仪检测血脂水平,Western blot检测主动脉ULK1、Beclin1、LC3、p-mTOR的蛋白表达。结果 与正常组相比,模型对照组TG、TC和LDLC水平升高（P〈0.05）,HDLC水平降低（P〈0.05）,主动脉管腔见较大粥样斑块,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平下调（P〈0.01）,pmTOR蛋白表达水平上调（P〈0.01）;与模型对照组相比,绞股蓝总甙组和辛伐他汀组TG、TC和LDLC水平降低（P〈0.05）,HDLC水平升高（P〈0.05）,主动脉管腔粥样斑块明显减少,ULK1、Beclin1、LC3蛋白表达水平上调（P〈0.01）,p-mTOR蛋白表达水平呈下调趋势（P〈0.01或P〈0.05）。结论 绞股蓝总甙可能通过调控自噬缓解动脉粥样硬化斑块形成,进而防治动脉粥样硬化。

丹参酮ⅡA对大鼠缺血再灌注肾组织AMPK/ULK1通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA对大鼠肾缺血再灌注后腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)/自噬激活激酶1(ULK1)通路的影响,探讨其肾脏保护的作用机制。方法将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为丹参酮ⅡA组、缺血再灌注组、假手术组,每组10只。丹参酮ⅡA组于缺血前30 min尾静脉注射丹参酮ⅡA注射液0.5 mg/kg,假手术组和缺血再灌注组注射等量的生理盐水。丹参酮ⅡA组和缺血再灌注组通过双侧肾蒂夹闭45 min的方法建立肾缺血再灌注模型,假手术组打开腹腔后不夹闭双侧肾蒂。再灌注24 h后心脏采血,检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平;取肾组织,采用HE染色观察各组肾组织病理改变,Western blot法测定肾组织中AMPK、ULK1表达水平。结果缺血再灌注组大鼠血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6、IL-10水平及肾组织中AMPK、ULK1表达水平均明显高于假手术组(P均<O.05);丹参酮ⅡA组大鼠血清Cr、BUN、TNF-α、IL-6水平及肾组织中AMPK、ULK1表达水平均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05),血清IL-10水平明显高于缺血再灌注组(P<0.05);丹参酮ⅡA组大鼠肾组织病理学改变明显轻于缺血再灌注组。结论丹参酮ⅡA能减轻肾缺血再灌注造成的肾损伤,其可能通过抑制AMPK/ULK1通路调控自噬,减轻肾脏炎症反应而起肾脏保护作用。

人参皂苷Rg1通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬延缓小鼠脑衰老的研究

目的探讨人参皂苷Rg1通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬延缓小鼠脑衰老的机制。方法C57BL/6J♂小鼠随机分为4组:脑衰老模型组、对照组、Rg1抗衰老组、自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)抗衰老组。建模完成后于次日进行各实验指标的检测。水迷宫实验检测小鼠学习与记忆能力;制备脑海马区石蜡切片,进行HE、Nissl染色与免疫组化染色,分别观察海马区神经元形态并计数神经元和Nissl小体数量与检测海马区神经元自噬相关蛋白p62、ATG5、ULK1;制备脑组织匀浆,检测脑组织乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,CEAh)的活性;Western blot检测脑组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、p62、Beclin1、p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR与凋亡蛋白p53。结果水迷宫实验表明Rg1与Rap使脑衰老小鼠的学习与记忆能力明显提升;HE、Nissl染色表明Rg1与Rap使脑衰老小鼠海马区神经元变性、坏死细胞减少,Nissl小体数量增多;免疫组化显示Rg1与Rap使海马区神经元自噬蛋白p62表达下降、ATG5与ULK1表达上升;Rg1与Rap使脑衰老小鼠AhCE活性下降;Western blot表明Rg1与Rap使脑衰老小鼠的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、p-AMPK/AMPK表达增加、p-mTOR/mTOR、p62、p53表达减少。结论人参皂苷Rg1能有效拮抗D-gal对小鼠脑的致衰老作用,其机制与Rg1通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬途径有关。

胰升糖素样肽1对肥胖大鼠肝脏组织中Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的干预效应

目的:研究胰升糖素样肽1受体激动剂利拉鲁肽对肥胖大鼠肝脏组织Sesn2/AMPK/mTOR信号通路的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为正常饮食组(NC组)与高脂饮食组(HF组),喂养12周后,每组取5只评估肥胖大鼠模型建立。HF组再随机分为HF组、低剂量利拉鲁肽组(LG组)、中剂量利拉鲁肽组(MG组)与高剂量利拉鲁肽组(HG组),各组分别给予生理盐水及不同剂量利拉鲁肽(50、100和200μg/kg,皮下注射,每天2次) 4周。16周时测定体重及附睾脂肪指数;取大鼠肝脏组织HE染色观察肝脏脂肪变性情况; Western blot法检测肝脏组织中Sesn2、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白水平。结果:HF组大鼠的体重明显高于NC组(P <0. 01)。HF组肝脏细胞出现脂肪变性。与NC组相比,HF组的Sesn2蛋白水平明显降低(P <0. 01),p-AMPK/AMPK水平明显降低(P <0. 01),而p-mTOR/mTOR水平与NC组相比差异没有统计学显著性。利拉鲁肽干预4周后,药物处理组大鼠体重明显低于HF组(P <0. 01),MG与HG组大鼠的附睾脂肪指数较HF组降低(P <0. 01),肝组织脂肪变性较HF组减轻; HG组的Sesn2蛋白水平明显高于HF组(P <0. 01),MG与HG组的p-AMPK/AMPK水平较HF组明显升高(P <0. 01),LG组、MG与HG组p-mTOR/mTOR水平较HF组明显降低(P <0. 01)。结论:胰升糖素样肽1受体激动剂可能通过Sesn2/AMPK/mTOR信号通路影响机体能量代谢,改善肥胖状态。

基于“以枢调枢”理论从AMPK/ULK1介导自噬通路探析背俞指针疗法防治胃食管反流病可行性

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是一种以胃内容物反流引起的不适症状为临床特征的消化系统疾病,如缺乏合理有效的防治措施,必然会加重患者的经济负担,影响患者的生活质量以及生命健康。各种受体介导的细胞信号转导参与了人体多种生物功能的调节,通过抑制或激活其功能,可以达到治愈疾病的目的。细胞的信号转导目前已经被应用于中医藏象学的研究中。“以枢调枢”理论为谢胜教授几十年临床经验探索而来,临床实践已证明了其治疗GERD具有确切疗效。背俞指针疗法可通过纠正脏腑气机失衡的状态,促进任督二脉经气交会而发挥防治GERD的作用。本文基于中医脏腑学理论,阐述了GERD的中医发病机制,通过查阅文献及结合前期研究提出了从AMPK/ULK1介导自噬通路探析背俞指针疗法防治GERD的方法与思路。

右美托咪定预处理激活PI3K/mTOR/ULK1通路发挥抗氧化应激和保护大鼠脑缺血/再灌注损伤的分子机制研究

目的探索右美托咪定(Dex)预处理在缓解大鼠脑缺血/再灌注(CI/R)损伤中的作用及其分子机制。方法选取48只6~8w龄雄性SD大鼠,每组12只,随机分为假手术(Sham)组,大脑中动脉闭塞(MCAO)模型组,Dex预处理(MCAO+Dex)组和ULK1抑制剂(SBI-0206965)联合Dex预处理(MCAO+Dex+SBI-0206965)组。TTC染色检测脑梗死体积并计算脑水肿指数;ELISA测定大鼠脑组织活性氧自由基(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平;Western blot检测大鼠脑组织自噬标志物LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin、p62的表达及PI3K/mTOR/ULK1通路p-PI3K、p-mTOR及p-ULK1的水平。结果与假手术(Sham)组相比,MCAO组大鼠脑梗死体积百分比、脑水肿指数、ROS和MDA水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Beclin的表达显著升高(P<0.01),SOD水平、p62、p-PI3K、p-mTOR及p-ULK1的水平显著下调(P<0.01)。与MCAO组相比,Dex组显著逆转了上述情况(P<0.01)。而SBI-0206965抵消了Dex预处理的保护作用,与Dex组相比,MCAO+Dex+SBI-0206965组大鼠脑梗死体积百分比和脑水肿指数显著升高(P<0.01),氧化应激水平及自噬标志物的表达显著上调(P<0.01),并下调SOD水平及抑制PI3K/mTOR/ULK1通路的活化(P<0.01)。结论Dex预处理是通过激活PI3K/mTOR/ULK1通路发挥抗氧化应激和保护大鼠脑缺血/再灌注损伤的,抑制ULK1的磷酸化,将抵消Dex的保护作用。

氟通过AKT/mTOR/ULK1信号通路对破骨细胞自噬的影响

背景氟可诱导破骨细胞分泌多种酶,使其吸收骨质的功能增强或减弱,从而溶骨或成骨,破骨细胞活化后骨吸收过程又与自噬密切相关。目的探究氟通过AKT/mTOR/ULK1信号通路对破骨细胞自噬的影响。方法采用RAW264.7细胞诱导形成的破骨细胞进行实验,分为对照组、NaF组、CQ组、CQ+NaF组、RAP组、RAP+NaF组,分别对相应组进行10 mg/L NaF、5 mmol/L CQ和5 mmol/L RAP给药,24 h后进行激光共聚焦显微镜检测,对破骨细胞自噬小体进行定量;荧光定量PCR检测Cathepsin K和TRAP的基因转录表达;Western blotting检测AKT/mTOR/ULKl磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-ULK1水平,探究自噬在染氟破骨细胞的作用。结果激光共聚焦显微镜结果显示10 mg/L氟化钠溶液能够促进自噬小体的产生,自噬小体的数量明显增多,氟化钠协同RAP激动自噬。荧光定量PCR结果显示氟化钠使Cathepsin K基因和TRAP基因的表达降低,并且氟化钠与CQ对两种基因的表达降低有协同作用,氟化钠拮抗RAP,激发自噬,抑制Cathepsin K和TRAP基因上调。Western blotting显示氟化钠能够使p-AKT和p-mTOR蛋白表达量上调,并且能协同RAP使p-AKT、p-mTOR和p-ULK1表达量增高。结论10 mg/L氟化钠溶液促进破骨细胞自噬,抑制其骨吸收能力从而成骨,可能与AKT/mTOR/ULK1信号通路有关。

丹酚酸B通过mTOR/Ulk1信号通路诱导胶质瘤细胞C6自噬性死亡

目的:探究丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)对胶质瘤细胞自噬的作用机制。方法:不同浓度的Sal B处理细胞,CCK8检测细胞活性,流式检测细胞凋亡情况,Western blot检测增殖、凋亡及自噬标记蛋白表达,免疫荧光检测LC3含量。结果:Sal B浓度达到100μmol/L时能明显抑制细胞活性,因此,选择10、20、50μmol/L三个剂量进行后续试验;Sal B能显著促进C6细胞凋亡和凋亡标记蛋白caspase-3、Bax的表达,降低Bcl-2及增殖标记蛋白Ki67的表达水平,并具有量效关系;同时,Sal B能显著促进自噬标记蛋白(Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1)的表达,升高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值,促进LC3荧光斑点的形成并降低p62的表达水平;此外,Sal B可明显抑制m TOR/Ulk1通路蛋白m TOR的表达,促进Ulk1的表达。结论:Sal B可通过m TOR/Ulk1信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡。

罗氟司特通过mTOR/ULK1/Atg13通路改善支气管哮喘小鼠气道炎症反应的研究

目的探讨罗氟司特对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(Atg13)通路的调控作用,以及对支气管哮喘(BA)小鼠气道炎症反应的影响。方法将60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、罗氟司特组(1.0 mg/kg)、自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤,3MA)组(10.0 mg/kg)、自噬激活剂[mTOR抑制剂雷帕霉素,1.0 mg/kg]组,罗氟司特+雷帕霉素组(1.0 mg/kg+1.0 mg/kg),每组10只。用卵清蛋白致敏法诱导建立小鼠BA模型,各组小鼠均给药4周。末次给药结束后,应用动物肺功能仪检测小鼠肺功能;取支气管肺泡灌洗液(BALF)检测炎症细胞数目;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测BALF中γ-干扰素(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;苏木精-伊红(HE)及过碘酸-雪夫(PAS)染色检测肺组织结构变化及气道杯状细胞化生情况;透射电镜下观察自噬泡形成情况;TUNEL法检测气道上皮细胞凋亡情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测Atg13、磷酸化Atg13(p-Atg13)、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、ULK1特定位点Ser757蛋白(ULK1 Ser757)及其磷酸化蛋白(p-ULKl Ser757)、自噬标记蛋白微管相关蛋白轻链3B(LC3B)、自噬相关蛋白(Beclin1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、白细胞介素-33(IL-33)、黏液高分泌性标志蛋白(黏蛋白MUC5AC)表达水平。结果与正常对照组相比,模型组小鼠肺功能下降,肺组织炎症细胞聚集及杯状细胞化生症状严重,mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化蛋白表达降低,自噬相关蛋白表达水平、炎症因子水平及凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,罗氟司特组及3MA组小鼠气道上皮细胞自噬及凋亡减少,mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。雷帕霉素可逆转罗氟司特的上述缓解作用(P<0.05)。结论罗氟司特可通过促进mTOR/ULK1/Atg13通路磷酸化活化,阻断自噬,抑制气道炎症及上皮细胞凋亡的发生,进而缓解BA病理症状。

促卵合剂调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路改善卵泡发育不良大鼠氧化应激及凋亡的作用机制

目的:探讨促卵合剂通过调控腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1/血管内皮生长因子(AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF)通路改善卵泡发育不良(FM)大鼠氧化应激及凋亡的作用机制。方法:将48只雌性SD大鼠随机分为正常组8只,造模组40只,造模组大鼠连续灌胃雷公藤多苷混悬液(75 mg·kg^(-1))30 d进行造模,造模后随机分为模型组、克罗米芬组(4.5 mg·kg^(-1))、促卵合剂低、中、高剂量组(8.1、16.2、32.4 g·kg^(-1)),每组8只。相应剂量药物给药,正常组及模型组灌胃等体积灭菌水,连续干预14 d。巴氏染色检测各组大鼠动情周期变化;苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢组织病理学及卵泡计数;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)含量;化学荧光法检测卵巢组织中活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡率;免疫组化法检测卵巢组织B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠动情周期紊乱,次级、成熟卵泡减少,闭锁卵泡增多,血清FSH及LH含量,卵巢组织ROS含量、Bax表达、卵巢颗粒细胞凋亡率、AMPK mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2表达、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,克罗米芬组及促卵合剂高、中剂量组次级卵泡和成熟卵泡增加,闭锁卵泡显著减少,血清FSH及LH含量、卵巢组织ROS含量、Bax表达、细胞凋亡、AMPK mRNA及蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),E2含量、SOD活性、Bcl-2、mTOR、HIF-1、VEGF mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01)。结论:促卵合剂可能通过调控AMPK/mTOR/HIF-1/VEGF通路来抑制氧化应激减少颗粒细胞凋亡,促进卵泡正常发育成熟,减少卵泡闭锁,保护卵巢功能,进而对FM发挥治疗作用。