ANF基因转染人血管平滑肌肉瘤细胞及其表达的实验研究

通过对体外传代培养的人血管起源平滑肌肉瘤细胞进行直接和脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的人心钠素（ＡＮＦ）基因表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ转染，并以非同位素地高辛标记的ＲＮＡ分子探针对转染细胞中的ＡＮＦｍＲＮＡ水平进行ＲＮＡＤｏｔＢｌｏｔ分子杂交检测，同时利用放射免疫方法测定转染细胞培养上清中的ＡＮＦ含量。结果显示，与未经脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ直接进行细胞转染及低浓度脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ进行细胞转染相比，脂质体Ｔｆｘ－５０与ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ以３∶１（荷质比）进行包裹，并当ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ在细胞数为１０５达到２．０μｇ时，细胞中ＡＮＦｍＲＮＡ表达阳性，转染细胞培养上清中ＡＮＦ含量达到５８．０ｎｇ／Ｌ。表明通过脂质体Ｔｆｘ－５０介导可以提高ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ的转染效率，并使细胞表达ＡＮＦ显著增加。

斑马鱼ANF基因的克隆及多克隆抗体的制备

心房钠尿肽ANF是钠尿肽家族中的一员,是心肌细胞分泌的一种循环激素,主要在心房组织分泌。生物信息学分析表明,斑马鱼ANF基因开放阅读框全长321bp,编码106个氨基酸,PCR扩增获得斑马鱼ANF基因全长。将所得的PCR片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-ANF)转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导表达GST-ANF融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的高效价性和特异性。