ANKIB1的克隆、原核表达和纯化

含锚蛋白重复序列和IBR结构域蛋白1(ANKIB1)含有RING-IBR-RING结构域、ANK模体和泛素结合模体,可能具有E3泛素连接酶活性和特殊的催化机制,但其功能目前所知甚少。采用巢式PCR技术分段扩增了人ANKIB1基因的cDNA,并通过基因重组构建了全长ANKIB1基因的完整编码序列。将ANKIB1连接到原核表达载体pGEX-5X-3中,用于表达GST-ANKIB1融合蛋白。在含有RING型蛋白稳定剂ZnCl2的培养基中,转化pGEX-5X-ANKIB1的大肠杆菌BL21(DE3)经过0.1 mmol/L IPTG在15℃低温条件下诱导10 h,成功表达了分子量高达148.5 kD的可溶性GST-ANKIB1蛋白。利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析,纯化了GST-ANKIB1融合蛋白。

ANKIB1单克隆抗体的制备及应用

目的:制备抗人ANKIB1的小鼠单克隆抗体。方法:PCR扩增人ANKIB1(1-480)的编码序列,构建pGEX-5X-ANKIB1(1-480)表达载体。在大肠杆菌中诱导表达GST-ANKIB1(1-480),利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。使用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot和免疫沉淀实验鉴定抗体,并检测ANKIB1在哺乳动物细胞中的表达。结果:获得了一株杂交瘤细胞株(7A9),所分泌的抗体对人、大鼠和小鼠ANKIB1均具有很高的灵敏性和特异性。ANKIB1在哺乳动物细胞中高表达。结论:成功制备了抗ANKIB1的单克隆抗体,ANKIB1在人、大鼠和小鼠脑以及人胚肾细胞293ET中均有较高水平的表达。

circ ANKIB1通过miR-217/DKK1轴调控骨肉瘤恶性生物学行为的机制研究

目的探讨circ ANKIB1在骨肉瘤中的确切作用和调控机制。方法采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨肉瘤组织中circ ANKIB1、miR-217和DKK1的表达水平。将质粒si-circ ANKIB1、pcDNA-circ ANKIB1、miR-217 inhibitor、miR-217 mimics、si-DKK1转染至骨肉瘤细胞,分别上调或下调circ ANKIB1、miR-217和DKK1的表达,集落形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,细胞划痕愈合实验检测细胞迁移能力。Western blot检测E-cadherin、N-cadherin蛋白水平。通过miRanda或TargetScan预测miR-217与circ ANKIB1或DKK1之间的靶向关系,并通过双荧光素酶报告基因检测证实。结果在骨肉瘤组织中,circ ANKIB1和DKK1高表达,而miR-217低表达。敲低circ ANKIB1通过诱导细胞凋亡抑制细胞增殖、迁移和上皮间质转化,从而抑制骨肉瘤的进展。miR-217是circ ANKIB1的直接靶点,其抑制逆转了circ ANKIB1敲低对骨肉瘤细胞进展的抑制作用,且敲低miR-217促进了骨肉瘤细胞增殖、迁移和上皮间质转化。DKK1是miR-217的直接靶点,在骨肉瘤细胞中发挥促癌作用。此外,circ ANKIB1通过海绵吸收miR-217正向调控DKK1的表达。结论circ ANKIB1的下调通过miR-217/DKK1轴抑制骨肉瘤的进展。