ANKRD22检测抗体制备及其在结直肠癌中的表达

目的制备特异性锚蛋白重复结构域蛋白22 (ANKRD22)抗体,了解ANKRD22在结直肠癌中的表达。方法用pET-42a表达系统从大肠杆菌中表达重组人ANKRD22蛋白,纯化后免疫Balb/c小鼠,以高表达ANKRD22的293T细胞裂解液为抗原,采用免疫印迹法筛选抗人ANKRD22特异性单克隆抗体;采用免疫组织化学染色法检测112例结直肠癌患者组织芯片中ANKRD22的表达。结果本研究获得了93个杂交瘤细胞,筛选出4株抗人ANKRD22特异性单克隆抗体,均与天然的人ANKRD22呈良好反应。ANKRD22主要分布于结直肠癌细胞的细胞质。在112例患者结直肠癌组织中,ANKRD22表达阳性94例,阳性率为83.93%。ANKRD22表达阳性与p53表达和β-catenin表达存在统计学关联(P<0.05),而与年龄、性别、结直肠肿瘤位置、临床AJCC分期、Dukes分期、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移和错配修复基因表达均无统计学关联(P>0.05)。结论 ANKRD22在结直肠癌组织中表达水平较高,可能参与了结直肠上皮的癌变过程,是一个潜在的辅助诊断标志。

基于生物信息学和实验验证分析巨噬细胞极化在肺结节病中的作用

目的通过生物信息学分析和实验验证探讨巨噬细胞极化在肺结节病中的作用。方法本研究为实验研究。从基因表达综合数据库下载肺结节病相关RNA-seq数据集GSE83456、GSE34608、GSE42834、GSE16538、GSE18781、GSE19314、GSE19976和GSE37912。将GSE83456数据集作为训练集,其余数据集作为验证集。采用非随机抽样的方法选取2021年1月至2023年1月于成都医学院第一附属医院住院的15例肺结节病患者(Ⅰ期或Ⅱ期)、15例肺结核患者和15例肺腺癌患者,以及同期接受体检的20名健康受试者为研究对象,收集肺结节病患者和健康受试者的外周血样本,收集肺结节病、肺结核和肺腺癌患者的纵隔淋巴结样本(肺腺癌患者淋巴结转移阴性)。通过"xCell"包分析GSE83456数据集中巨噬细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞在肺结节病患者中的丰度变化,并通过流式细胞术检测肺结节病患者和健康受试者外周血M1和M2巨噬细胞比例。通过基因集富集分析探索肺结节病组与对照组、高M1巨噬细胞组与低M1巨噬细胞组、高M2巨噬细胞组与低M2巨噬细胞组之间的潜在生物学差异。加权基因共表达网络分析筛选与巨噬细胞极化高度相关的模块基因,将GSE83456数据集中肺结节病组和对照组的差异基因与相关模块基因取交集,得到巨噬细胞极化相关差异基因,并对其进行基因本体论富集分析。通过Lasso回归和随机森林算法筛选出肺结节病患者巨噬细胞极化关键基因,并在验证集中验证关键基因的表达情况,对GSE83456数据集中关键基因与巨噬细胞丰度的关系进行Pearson相关分析。通过蛋白质印迹法验证关键基因在肺结节病、肺结核和肺腺癌患者纵隔淋巴结中的蛋白表达水平。绘制受试者工作特征曲线分析关键基因表达蛋白鉴别肺结节病和肺结核的价值。结果在GSE83456数据集中,肺结节病组巨噬细胞、M1巨噬细胞丰度评分均高于对照组[(0.27±0.09)分比(0.12±0.07)分,(0.18±0.07)分比(0.12±0.04)分,均P<0.001]。肺结节病患者外周血M1巨噬细胞比例和M1/M2巨噬细胞比值均高于健康受试者[(0.60±0.12)比(0.47±0.11),(1.23±0.07)比(0.84±0.06),均P<0.05]。炎症反应和干扰素反应等免疫相关通路富集于肺结节病组和高M1巨噬细胞组。加权基因共表达网络分析与差异基因分析的交集共获得32个巨噬细胞极化相关的差异基因,这些基因主要富集于免疫相关的生物过程和分子功能。Lasso回归和随机森林算法筛选出肺结节病患者巨噬细胞极化关键基因ANKRD22。在7个验证集中,肺结节病组ANKRD22 mRNA表达量均高于对照组,并且在GSE42834数据集中肺结核组ANKRD22 mRNA表达量高于肺结节病组(均P<0.001)。Pearson相关分析显示,在GSE83456数据集中,ANKRD22 mRNA表达量与巨噬细胞丰度(r=0.65)、M1巨噬细胞丰度(r=0.54)和单核细胞丰度(r=0.45)均呈正相关(均P<0.001)。蛋白质印迹法显示,肺结核患者和肺结节病患者的ANKRD22蛋白相对表达量均高于肺腺癌患者,且肺结核患者高于肺结节病患者[(0.98±0.02)比(0.38±0.03),(0.62±0.02)比(0.38±0.03),(0.98±0.02)比(0.62±0.02),均P<0.05]。ANKRD22蛋白鉴别肺结节病和肺结核的曲线下面积为0.802,最佳截断值为0.58,敏感度为73.3%,特异度为80.0%。结论M1巨噬细胞介导免疫炎症反应参与肺结节病的发生发展。肺结节病巨噬细胞极化关键基因ANKRD22可以作为肺结节病的潜在生物标志物,并具有鉴别肺结节病和肺结核的潜在价值。