^(99)Tc^m标记annexinV进行体内凋亡显像的研究

细胞凋亡早期 ,磷脂酰丝氨酸 (PS)从细胞膜脂双层的内层迁移至外层。根据磷脂结合蛋白 V(annexin V )高度亲和 PS的特性 ,利用 99Tcm标记的 annexin V可以进行体内凋亡细胞的显像。

CFSE和AnnexinV双标记技术检测细胞毒性T淋巴细胞的杀伤效应

目的利用CFSE和AnnexinV对靶细胞进行染色，建立一种通过流式细胞仪技术检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤效应的新方法。方法应用磁珠分选OT—IT细胞受体（TCR）转基因小鼠CD8＋CTL细胞和脾脏树突状细胞（sDC），将2种细胞和鸡卯蛋白（OVA）抗原肽共培养65h后分析其细胞分裂增殖、IFN-γ和IL-4细胞内因子及穿孔素、颗粒酶等效应分子的表达特性，收获具备杀伤效应的CD8＋CTL细胞。利用预先激活的小鼠CD8^＋CTL细胞作为效应细胞，CFSE标记的同系小鼠脾细胞作为靶细胞，体内体外2种条件下利用AnnexinV染色靶细胞检测特异性CTL杀伤效应，并与CFSE^high曲和CFSE^low标记靶细胞检测体内CTL杀伤效应的经典方法进行比较。结果OT—I初始CD8^＋CTL细胞体外活化培养后有4个分裂峰，54．1％的CTL细胞表达IFN-γ，0．78％的细胞表达IL-4，穿孔素、颗粒酶2种CTL效应分子均为阳性表达，CD8＋CTL细胞已经具备CTL杀伤活性。体外实验结果显示OVA^＋靶细胞在共培养条件下，AnnexinV阳性细胞比例明显高于分离培养条件下[（62．4±3．5）％比（28．3±2．2）％，P〈0．01]，OVA的AnnexinV阳性靶细胞比例在不同培养条件下差异无统计学意义[（20．3±4．8）％比（17．3±2．9）％，P〉0．05]。共培养条件下OVA^＋靶细胞其AnnexinV阳性细胞比例也明显高于OVA^-靶细胞（P〈0．01），在分离培养条件下差异则无统计学意义（P〉0．05）。活化的CD8^＋CTL细胞所介导的杀伤效应具有抗原依赖性和部分的细胞接触依赖性。体内CTL实验中，利用CFSE和AnnexinV双标记的方法检测出靶细胞的杀伤率高于未孵育OVA抗原肽的对照组靶细胞[（52．63±8．12）％比（13．84±4．37）％，P〈0．01]。而同等条件下利用CFSE^high和CFSE^low双标记的方法检出靶细胞杀伤率为41%。结论CFSE和AnnexinV双标记靶细胞的方法检测CTL杀伤效应与单纯的使用CFSE^high和CFSE^low标记靶细胞方法有很好的可比性，该策略为利用流式细胞仪技术检测细胞杀伤功能的方法学提供了新的选择。

狗舌草提取物对多发性骨髓瘤U266细胞周期及凋亡标志物AnnexinV／PI的作用

目的 研究狗舌草提取物对U266细胞周期及凋亡标志物AnnexinV/PI的作用.方法 U266细胞株与狗舌草提取物共同培养,用流式细胞仪测定细胞周期及凋亡标志物AnnexinV/PI.结果 狗舌草总提取物影响266细胞周期,G0/G1期细胞减少,S期、G2/M期细胞增加,凋亡细胞增加,用AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测,均显示细胞凋亡与狗舌草提取物有剂量依赖关系.结论 狗舌草提取物对U266细胞有诱导细胞凋亡作用.

应用AnnexinV-FITC/PI-FCM定量分析对5-FU诱导卵巢癌细胞系凋亡的研究

目的 应用AnnexinV -FITC/PI -FCM定量分析 5 -氟尿嘧啶 (5 -FU)诱导卵巢癌细胞系OVCAR发生的凋亡。方法 将 5 -FU以 0、2 0mg/L、10 0mg/L、2 0 0mg/L的浓度 ,分别处理OVCAR细胞 12、2 4、48小时 ,然后用形态学观察、DNA琼脂糖电泳和AnnexinV -FITC/PI流式细胞技术 (flowcytometric,FCM)检测其诱发凋亡的情况。结果 AnnexinV -FITC -FCM分析见 ,随 5 -FU作用浓度增加、时间延长 ,凋亡细胞比例明显升高 ,差异显著 (P <0 .0 1) ,继发性坏死细胞比例增加 ,差异明显 (P <0 .0 5 )。结论 5 -FU可以诱发OVCAR细胞发生凋亡 ,应用AnnexinV -FITC/PI -FCM能对细胞凋亡定性的同时测出活细胞、凋亡细胞、继发性坏死细胞和培养操作过程中出现机械损伤细胞的比例 ,与传统方法相比 ,更能直观。

去甲斑蝥素通过JAK-STAT3途径诱导结肠癌LS-174T细胞凋亡

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)诱导结肠癌LS-174T细胞的凋亡效应及其可能分子机制。方法应用MTT法检测NCTD对细胞生长的抑制作用,通过AO/EB染色、透射电子显微镜观察细胞形态及超微结构的变化,AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡率,Western blot检测stat3、survivin、Mcl-1、bax蛋白的表达情况。结果去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞具有显著的生长抑制作用,并呈时间—剂量依赖性;40μg/ml作用72 h时达到最大抑制率(72.4±3.1)%;AO/EB染色及流式细胞术显示,随着NCTD浓度的增加,细胞凋亡率明显增加;透射电子显微镜观察发现,结肠癌LS-174T细胞出现明显凋亡超微结构变化;Western blot结果显示,stat3、survivin、Mcl-1表达明显下降,bax表达明显上升。结论去甲斑蝥素可以抑制结肠癌LS-174T细胞的生长并促进其凋亡,机制可能是通过抑制stat3途径实现的。

RBL-2H3细胞诊断过敏性休克的可行性初探

目的 :探索诊断过敏性休克的体外检测方法。方法 :建立豚鼠过敏性休克模型 ,培养RBL 2H3细胞株 ,用致敏动物血清在体外诱导该细胞脱颗粒 ,观察其形态改变及测定组胺释放量与细胞表面AnnexinV标记阳性率。结果 :RBL 2H3细胞在致敏血清刺激下活化 ,在抗原再次攻击后可以脱颗粒 ,AnnexinV阳性率与组胺释放量呈正比 ,二者与致敏血清的滴度呈剂量依赖关系。结论 :RBL 2H3可望用于过敏性疾病诊断及变应原筛选 。

以Annexin V/PI法检测新风胶囊对AA大鼠滑膜、胸腺及胃黏膜细胞凋亡的影响

目的 观察以AnnexinV/PI法检测新风胶囊对佐剂性关节炎 (adjuvantarthritis,AA)大鼠滑膜、胸腺及胃黏膜细胞凋亡的影响 ,探讨新风胶囊的作用机制。方法 采用弗氏完全佐剂造成佐剂性关节炎 (AA)大鼠模型 ,设立正常对照组、模型对照组、甲氨喋呤 (MTX)对照组、雷公藤多苷

AnnexinⅤ-FITC/PI双标记流式细胞术检测结直肠癌细胞凋亡

目的:探讨化疗药物5氟尿嘧啶(5-FU)诱导肿瘤细胞凋亡的作用特性,同时分析AnnexinⅤ-FITC/PI双标记流式细胞术在检测细胞凋亡中的应用。方法:采用不同浓度的5-FU作用于培养的结直肠癌细胞株colo320,并设不同的时间段,应用流式细胞术和Hoechst33342荧光染色两种方法观察5-FU诱导肿瘤细胞凋亡的时间、剂量特性。结果:5-FU可以诱导colo320细胞的凋亡,80μg/ml作用4h后AnnenxinⅤ单阳性即开始增多,至12h,AnnenxinⅤ及PI双阳性即坏死细胞也开始增加。随药物浓度的提高,各组凋亡细胞所占比例也随之升高。流式细胞术与荧光染色的结果保持一致。结论:化疗药物5FU诱导肿瘤细胞凋亡作用呈时间、剂量依赖。AnnexinⅤ-FITC/PI双标记流式细胞术可用于检测早期的细胞凋亡事件,简单、灵敏,可作为检测细胞凋亡的首选方法。

放射性Annexin V活体检测细胞凋亡的研究进展

概述了放射性AnnexinV活体检测细胞凋亡的研究状况,介绍了这类显像剂在医学临床研究上的优越性,并对放射性标记AnnexinV显像剂的研究方法和进展进行了评述。

流式细胞术AV与PI双参数法检测胃癌早期凋亡的定量研究

目的 :应用流式细胞术AV/PI法研究胃癌组织的早期凋亡情况。方法 :手术标本分离单细胞悬液 ,经AV -FITC与PI标记后流式细胞仪测定凋亡率。结果 :分离的单细胞经标记检测后可明确区分凋亡细胞、坏死细胞与活细胞的比例 ;其比例关系在肿瘤组织与对照组之间有显著性差异。结论 :AV/PI双参数法流式细胞仪检测可用于胃癌组织的早期凋亡的检测 。

乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡机制

背景:有研究表明乙醇可诱导骨髓间充质干细胞凋亡并引起成骨细胞和破骨细胞数量减少,但乙醇对骨髓间充质干细胞凋亡的影响以及作用机制目前尚不十分清楚。目的:观察乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡、线粒体功能的影响及bcl-2、Caspase-3表达的变化。方法:应用全骨髓培养法分离培养SD大鼠骨髓间质干细胞,置于0,100,200,300,400,500,600,700,800,900mmol/L乙醇中作用24h,MTT法进行细胞毒性药物实验;置于0,100,200,300,400,500mmol/L乙醇中作用6,12,24h,AnnexinV/PI双标记法流式细胞仪检测细胞凋亡和线粒体膜电位变化情况;置于0,427mmol/L乙醇中作用24h,RT-PCR法检测与凋亡有关的基因bcl-2和Caspase-3mRNA表达水平。结果与结论:MTT检测结果显示427mmol/L是乙醇对大鼠骨髓间充质干细胞生长的半数抑制浓度;AnnexinV/PI检测结果表明,与0mmol/L组比较,随作用时间的延长与乙醇浓度的增加,骨髓间充质干细胞凋亡率及线粒体跨膜电位的破坏水平明显升高(P<0.05)。与0mmol/L组比较,乙醇作用24h后427mmol/L组bcl-2mRNA表达水平下降,Caspase-3mRNA表达水平增加(P<0.05)。说明乙醇能诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡,凋亡的发生可能与线粒体膜电位破坏、线粒体功能障碍、bcl-2和Caspase-3激活有关。

苯并(a)芘对神经细胞的毒性及细胞色素P4501A1的诱导表达

目的探讨苯并(a)芘[B(a)P]对神经细胞毒性、细胞凋亡与细胞色素P4501A1(CYP1A1)诱导表达的关系。方法选用新生1～3d的SD大鼠,分离大脑皮质,进行神经元培养,在细胞培养第5天左右,选取生长良好的同批次神经细胞,以苯并(a)芘分别对神经细胞染毒,使苯并(a)芘终浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L。继续培养40h,应用cck8试剂盒检测神经细胞活力、Annexin V和PI双染法进行细胞凋亡的检测,应用RT-PCR法检测神经细胞CYP1A1mRNA的表达,免疫组织化学SABC法检测神经元CYP1A1蛋白的表达。结果随着苯并[a]芘浓度的增加,神经细胞活力降低,早期凋亡率逐渐增高,细胞活力中高剂量组与对照组比较差异均有统计学意义,早期凋亡率仅高剂量组与对照组比较差异有统计学意义,趋势检验表明,细胞活力降低、凋亡率增高具有剂量依赖性。而且随B(a)P剂量的增高,CYP1A1mRNA及蛋白表达增多,有剂量-反应关系,CYP1A1基因和蛋白表达与神经细胞凋亡率的相关分析表明,神经细胞凋亡率与CYP1A1mRNA表达呈正相关(r=0.831,P<0.01);与CYP1A1蛋白表达呈正相关(r=0.780,P<0.01)。结论苯并[a]芘可致神经细胞凋亡,神经细胞CYP1A1诱导表达是神经细胞损伤的关键因素。

口腔修复非贵金属材料对L-929细胞凋亡的影响

细胞外部因素通过信号传递而影响基因的表达从而间接地调节细胞凋亡。本实验利用流式细胞仪，检测口腔修复非贵金属材料对L-929细胞凋亡的影响。1材料与方法1．1主要试剂与仪器：纯钛（西北有色金属研究院），钛合金（日本），钴铬合金（德国），镍铬合金（德国），铜基合金（四川大学材料成型及控制系），RPMI1640培养基（Invitrogen公司）．胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料研究所），胰蛋白酶（Sigma．德国）．AnnexinV—EGFP试剂盒（北京宝赛），

DC凋亡的流式细胞术分析

目的:探讨树突状细胞凋亡的流式检测方法。方法:采用Annexin V/PI双染法标记DC细胞,通过流式细胞术分析H2O2诱导产生的细胞凋亡情况。结果:本实验成功检测到细胞凋亡与死亡。结论:Annexin V与PI同时染色可成功检测DC细胞凋亡。

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。

晚期糖基化终产物调节内皮祖细胞功能及其机制研究

目的探讨晚期糖基化终产物(AGE)对内皮祖细胞(EPC)功能的影响以及可能的机制,从而阐明促进动脉粥样硬化(AS)发生的可能机制。方法密度梯度离心法分离健康成人PBMNC,经含重组人血管内皮细胞生长因子(30 ng／mL)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(10 ng／mL)和20％新生牛血清的M199培养基培养,在第8天收集贴壁细胞鉴定,同步化后第9天供实验用。细胞分组后分别加入不同浓度的晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA)(0、人血清白蛋白(HSA)、25、50、100、200、300μg／mL)干预24 h和蛋白浓度为200μg／mL的AGE-HSA干预0、6、12、24、30、36 h,用荧光定量逆转录聚合酶链反应和Western-blot技术检测RAGE基因和蛋白的表达。细胞分组后用200μg／mL AGE-HSA干预EPC 0、10、20、30、40 min, Western-blot检测丝裂原激活蛋白激酶(MAPK),即磷酸化细胞外信号调节激酶Erk、磷酸化c-Jun氨基端激酶Jnk、磷酸化P38 MAPK的表达;然后用AGE-HSA分别加上此三种激酶的抑制剂干预EPC,用Western-blot检测RAGE的表达,并设立空白对照组并加入与激酶抑制剂同等量体积的二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)。细胞分为5组:第1组为空白对照,第2组为阳性对照(200μg／mL AGE-HSA),第3组为抗RAGE中和抗体组,第4组为p38抑制剂SB203580组,第5组为Erk抑制剂PD98059,第3-5组先加入抗RAGE中和抗体、SB203580、PD98059孵育1小时,再加入AGEs-HSA培养24小时,结束前1小时加入BrdU,使其浓度为20μg／ml;按照LEUCOPERMTM5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)增殖检测试剂盒步骤收集细胞并处理后,行流式细胞仪检测细胞增殖情况;另外准备5组细胞同前,结束前1小时不加入BrdU,孵育24小时后离心收集上清液后,按照AnnexinV-FITC试剂盒步骤收集并处理细胞,,行流式细胞仪检测细胞凋亡情况;按ELISA试剂盒操作步骤测定收集的上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、可溶性血管细胞粘附分子-1(sVCAM-1)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)的浓度。结果荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察发现95％以上细胞摄取1,1’-二(十八烷基)-3,3’,3’,3’-四甲基吲哚羰基花青高氯酸(DiI)乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)(DiI-AC-LDL)并结合FITC标记荊豆凝集素(UEA)I(FITC-UEA-I)。流式细胞仪检测发现CD133阳性率在0．835±0．053;VEGF-R2阳性率0．862±0．082;CD34阳性率0．862±0．062。未经干预的EPC可表达少量的RAGE,用AGE-HSA干预后RAGE mRNA与蛋白的表达与对照组差异无统计学意义。50、100、150、200、300μg／ml的AGE-HSA可分别上调RAGE mRNA和蛋白的表达,且RAGE mRNA 150 1、200、300μg／ml组与对照组差异有统计学意义(P<0:05),50 1、100、150、200、300μg／mI组的RAGE蛋白表达与对照组和HSA组相比差异有统计学意义(P<0．05),200μg／ml时达到峰值(P<0．001)。AGE-HSA刺激磷酸化p38、Jnk-MAPK表达,在10 min时可见表达增加,20 min达高峰,以后开始下降:AGE-HSA刺激磷酸化Erk表达,在10 min时可见表达增加(P>0．05),30 min达到高峰,以后开始下降; p38 MAPK抑制剂SB203580, Erk-MAPK抑制剂PD98059可以抑制由AGE-HSA刺激引起的RAGE的表达,Jnk-MAPK抑制剂SP600125则无此作用。经流式细胞仪分析显示:第2组细胞增殖率与第1组、第3组、第4组、第5组相比显著降低;单纯AGE-HSA处理组细胞凋亡率与第1组、第3组、第4组、第5组相比显著增高;第3组的EPCs凋亡率与第1组相比显著下降。各组细胞上清液测定TNF-α、sVCAM-1、sICAM-1发现:第1组细胞低水平表达TNF-α、sVCAM-1、sICAM-1;第2组表达TNF-α、sVCAM-1、sICAM-1较第1组明显增高,这种升高趋势可以被RAGE中和抗体抑制,p38 MAPK抑制剂SB203580、Erk抑制剂PD98059不同程度降低。结论1)用密度梯度离心法分离人PBMNCs经rh-VEGF、rh-B-FGF的M199培养,可以分化为CD133、VEGF-R2、CD34阳性的EPCs。(2)AGE-HSA促进了EPCs RAGE的表达,并呈一定的浓度时间依赖性。(3)AGE-HSA激活了EPCs MAPK信号通路。p38 MAPK抑制剂SB203580,Erk-MAPK抑制剂PD98059和100ul／ml通心络超微粉溶液可以抑制由AGE-HSA刺激引起的RAGE的表达,Jnk-MAPK抑制剂SP600125则无此作用。说明AGE-HSA可能通过激活MAPK信号通路影响EPCs功能。(4) AGE-HSA促进EPCs的凋亡,抑制EPCs的增殖,并促进其分泌TNF-α、sVCAM-1、SICAM-1,而这种作用可以被抗RAGE中和抗体以及p38 MAPK抑制剂SB203580,Erk-MAPK抑制剂PD98059和100ul／ml通心络超微粉溶液抑制或部分抑制。

放射性核素标记annexin V凋亡显像在肿瘤研究中的进展

肿瘤细胞凋亡过低是肿瘤形成的重要原因之一,诱导肿瘤细胞凋亡也成了目前抗肿瘤治疗的研究方向。用放射性核素标记的annexinV对细胞凋亡后暴露在细胞膜表面的体内PS(膦脂酰丝氨酸)进行体内显像,可检测早期细胞凋亡。这种体内凋亡显像方法可以监测抗肿瘤治疗的疗效、评估患者的预后,甚至可以指导肿瘤治疗方法的选择,提高治疗的质量。

白屈菜红碱抗肺癌活性及其相关机制

肺癌在很多国家已经列居癌肿死因的第一位,虽然治疗技术的改进,但肺癌的5年生存率仍不超过15%。肺癌也是老年人常见的恶性肿瘤,据统计,50%以上的晚期非小细胞肺癌患者诊断时年龄超过65岁,老年患者因为体质等因素的影响多已错过最佳手术时机。