AO/EB染色法及流式细胞术检测DMF诱导人肝细胞凋亡

目的观察二甲基甲酰胺(DMF)诱导正常成人离体肝细胞凋亡情况。方法以50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L和200mmol/L剂量DMF对正常成人离体肝细胞染毒。采用AO/EB双重染色法进行形态学观察;流式细胞术检测细胞凋亡率变化。结果AO/EB染色可见:活细胞核染色质着绿色,死亡细胞核染色质着橘红色,晚期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状,早期凋亡细胞核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状。染毒组早期凋亡细胞多于阴性对照组,随剂量增高,晚期凋亡细胞和死亡细胞也增多。不同剂量组间染毒24小时后,流式细胞术散点图可见,随染毒剂量增加,活细胞率逐渐下降,以200mmol/L剂量组的活细胞率最低。经单因素方差分析,空白对照组和各剂量组间早期凋亡细胞占细胞总数的百分率差异有统计学意义(F=8.299,P<0.01),随染毒剂量增高,早期凋亡细胞率增加。结论一定浓度的DMF能诱导正常成人离体肝细胞发生凋亡,其早期凋亡率有随DMF浓度的增高而增高的趋势。

AO/EB染色观察华蟾素诱导体外肿瘤细胞凋亡

目的:观察华蟾素诱导肿瘤细胞凋亡的变化规律,找出最佳诱导剂量及最佳诱导时间.方法:采用人肝癌SMMC-7721和人胃癌MGC-80-3细胞株,以AO/EB染色对华赡素不同浓度及作用时间下细胞凋亡的形态变化进行观察,并定量计算出凋亡率.结果:在荧光显微镜下可区分早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、活细胞及坏死细胞.华蟾素诱导细胞凋亡的最佳浓度为0.12μg/ml,最佳诱导时间为20 小时左右.结论:华蟾素具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用.运用AO/EB染色研究细胞凋亡,具有方便、准确、可靠、便宜等优点,并能区分凋亡细胞及坏死细胞,值得推广运用.

AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡的研究

目的：检测细胞培养中凋亡细胞的形态及数量。方法：取４℃环境下不同时间培养的小鼠胸腺细胞，用ＡＯ／ＥＢ染色后荧光镜观察。结果：荧光镜下早期凋亡细胞发绿色或暗绿色荧光，伴有核结构的变化，晚期凋亡细胞发橙红色荧光并伴有凋亡小体的形成。结论：ＡＯ和ＥＢ双重荧光染色后，荧光镜检在细胞凋亡检测中既可定性，又可定量。

全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征

目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡的时相和分布特征，为神经元损伤的早期干预和继发性脑损害的防治提供实验依据。方法 建立大鼠全脑缺血模型，采用TTC染色、原位细胞凋亡检测（原位末端标记法，TUNEL）及AO／EB荧光比色法观察脑缺血再灌后海马、皮层凋亡发生的数量和分布，用荧光指示剂Fura-2 AM标记，检测脑海马细胞内游离钙的浓度。结果 TUNEL显示再灌注3h海马部位即出现散在凋亡细胞，并向皮层区域扩展，24—48h达高峰；坏死细胞迟于凋亡出现，弥散分布于凋亡细胞周围，再灌注48h后坏死细胞增多，72h最多。AO／EB法显示海马、额叶和顶叶凋亡细胞总数分布在再灌注后24h和72h达高峰，并显著高于对照组（P〈0．05）。TTC染色证实全脑缺血再灌注后不出现梗死灶，而是在海马及大脑皮层有弥散性坏死。胞内[Ca^2＋];各时间点与对照相比匀显著升高（P〈0．01）。结论 全脑缺血再灌后受累神经元经历了由凋亡到死亡的过程，对缺血敏感的海马神经元首先受损，并向顶叶和额叶皮层扩展，细胞质内[Ca^2＋]i增加是主要原因。利用凋亡时间窗进行早期干预可能有益于保护和挽救凋亡前期神经元，减小继发性损害的严重程度。

去甲斑蝥素通过JAK-STAT3途径诱导结肠癌LS-174T细胞凋亡

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)诱导结肠癌LS-174T细胞的凋亡效应及其可能分子机制。方法应用MTT法检测NCTD对细胞生长的抑制作用,通过AO/EB染色、透射电子显微镜观察细胞形态及超微结构的变化,AnnexinV/PI染色检测细胞凋亡率,Western blot检测stat3、survivin、Mcl-1、bax蛋白的表达情况。结果去甲斑蝥素对结肠癌LS-174T细胞具有显著的生长抑制作用,并呈时间—剂量依赖性;40μg/ml作用72 h时达到最大抑制率(72.4±3.1)%;AO/EB染色及流式细胞术显示,随着NCTD浓度的增加,细胞凋亡率明显增加;透射电子显微镜观察发现,结肠癌LS-174T细胞出现明显凋亡超微结构变化;Western blot结果显示,stat3、survivin、Mcl-1表达明显下降,bax表达明显上升。结论去甲斑蝥素可以抑制结肠癌LS-174T细胞的生长并促进其凋亡,机制可能是通过抑制stat3途径实现的。

镉对体外培养成骨细胞增殖、凋亡、分化及矿化的影响

目的探讨镉对体外培养成骨细胞(osteoblast,OB)增殖、凋亡、分化及矿化的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养;成骨细胞与不同浓度的Cd2+作用后,MTT法测定细胞增殖;AO/EB双染法进行凋亡形态学观察;PNPP法检测碱性磷酸酶活性;矿化结节计数和面积测量分析镉对成骨细胞矿化能力的影响。结果各剂量组氯化镉均可抑制成骨细胞增殖,其中2.0μmol/L以上剂量组与对照组相比差异有统计学显著意义(P<0.01);16.0μmol/L、32.0μmol/L剂量组OB可见较多凋亡细胞;各时点、各剂量组氯化镉均能抑制ALP活性,尤其是48h以上影响作用更明显(P<0.01);0.5μmol/L、1.0μmol/L浓度的氯化镉可明显抑制成骨细胞矿化能力。结论镉离子可以抑制成骨细胞增殖、分化及矿化能力,促进成骨细胞凋亡,对成骨细胞的骨形成能力有明显抑制作用。

姜黄素对人白血病K562细胞凋亡的影响

Ｋ５６２细胞对多种化疗药物诱导凋亡具有抗性，本文以ＡＯ／ＥＢ染色法、细胞分光光度术、ＤＮＡ凝胶电泳及电镜观察等方法，发现姜黄素可显著诱导Ｋ５６２细胞凋亡，提示该药对治疗慢性粒细胞性白血病可能有价值。

牛黄天龙胶囊(含药血清)诱导人子宫内膜癌HEC-B细胞凋亡及其机制

目的观察牛黄天龙胶囊(含药血清)对人子宫内膜癌HEC-B细胞能否诱导凋亡并对其抗癌机制进行探讨。方法实验组分低、中、高3个剂量组并设空白组和阳性对照组进行含药血清的制备;MTT法观察细胞毒作用;细胞排染法观察瘤细胞直接损害实验;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法及电镜(TEM)下观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡率并进行细胞周期分析,测定凋亡抑制蛋白survivin和凋亡效应蛋白Caspase-3的表达。结果MTT法:人子宫内膜癌HEC-B细胞经含药血清作用后细胞生长受到明显抑制且以低剂量组抑制率最高。细胞排染法:同一时间段内以低剂量组效果最好,不同时间段内(24、48h)细胞抑制率显著提高(P<0.01)。AO/EB和TEM:实验组均可见到典型细胞凋亡的形态学变化。FCM:实验组各组细胞凋亡率与空白组相比差异有显著性(P<0.01)且以低剂量组最高,细胞周期分析显示实验组G0/G1期细胞明显增多而S期细胞明显减少与空白组相比差异有显著性(P<0.01),Survivin蛋白表达在空白组最高,在实验组表达降低与空白组相比差异有显著性(P<0.01),Caspase-3表达则相反,在实验组表达最高与空白组相比差异有显著性(P<0.01)。结论复方中药“牛黄天龙胶囊”(含药血清)能够使人子宫内膜癌HEC-B细胞生长阻滞在G0/G1期并可诱导人子宫内膜癌HEC-B细胞凋亡;并可降低凋亡抑制蛋白survivin表达同时可提高凋亡效应蛋白Caspase-3表达,这可能是其诱导人子宫内膜癌HEC-B细胞凋亡的机制之一;对人子宫内膜癌HEC-B细胞的抗肿瘤作用并非浓度越大效果越好而有一最适剂量。

南蛇藤提取物体外抑瘤作用研究

目的:探讨南蛇藤提取物体外抗肿瘤作用及诱导细胞凋亡作用。方法:MTT法对南蛇藤提取物的分离成分进行初步筛选,在此基础上用吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双重荧光染色法观察南蛇藤乙酸乙酯提取物诱导SGC-7901细胞凋亡作用。结果:南蛇藤乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物有较强的抗肿瘤作用。南蛇藤乙酸乙酯提取物40 mg/L对SGC-7901细胞有明显诱导凋亡作用。

中药“龙泉复方”的不同配伍对肿瘤细胞系HepG-2和EC-1增殖的影响

通过MTT（四甲基偶氮唑盐）法绘制细胞增殖曲线观察药物对肝癌细胞系HepG-2和食管鳞癌细胞系EC-1细胞增殖的影响,用荧光染色法进一步确定＂龙泉复方＂有效成分诱导细胞凋亡的较佳配伍及其有效作用浓度范围.结果表明：对抑制HepG-2细胞增殖有效作用的浓度：七味单方（马钱子、山慈菇、喜树果、龙葵、石上柏、青黛、紫菀）浸膏混合物和龙葵单方浸膏均〈125μg/mL,七味药物复方总浸膏为250~1000μg/mL;对抑制EC-1细胞增殖有效作用的浓度：三味药物混合浸膏（马钱子,喜树果、青黛提取的浸膏的混合物）〈50μg/mL和150~400μg/mL,七味单方混合浸膏〈25μg/mL和50~400μg/mL,喜树果单方浸膏为25μg/mL和50~200μg/mL;3种浸膏促进EC-1细胞增殖的浓度依次为：50~100、25~50、25~50μg/mL.通过对EC-1荧光染色观察发现诱导细胞凋亡的有效作用浓度：七位单方浸膏混合物为5~10μg/mL,三味药复方混合浸膏为10~25μg/mL,喜树果约为50μg/mL.研究结果提示,药物浓度范围和细胞系的不同导致其效果也不尽相同,临床应据具体情况调整,使之用药少效果佳.

氨基葡萄糖硫酸盐诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的 探讨氨基葡萄糖硫酸盐(GS)对慢性髓系白血病K 5 62细胞凋亡诱导作用和分子机理。方法 采用台盼蓝拒染法测定细胞生长曲线来观察GS对K5 62细胞的生长抑制作用;取对数生长期K 5 62细胞,在0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS不同浓度作用48h后,利用细胞计数、电镜、吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色、DNA梯状电泳、流式细胞仪等方法来观察GS对K 5 62细胞的抑制效应和促凋亡作用。并用Westernblot检测活化的caspase 3和bcl- 2基因的表达。结果 0 .5 ,1.0 ,5 .0mmol/LGS对K 5 62细胞的生长有抑制作用,并呈时间和剂量依赖性(P <0 .0 1)。采用光镜、电镜和AO /EB染色法发现5mmol/LGS作用K 5 62细胞后,出现典型的凋亡形态学改变。AnnexinV染色后流式细胞仪能检测到早期凋亡细胞,细胞周期显示:G1期细胞比例增高,S期比例减低,并有凋亡峰。有明显的梯状DNA。同时GS诱导K 5 62细胞凋亡后出现活化的Caspase 3 ,而Bcl- 2蛋白表达减弱,甚至消失。结论 GS能诱导白血病K- 5 62细胞凋亡,该过程伴有Caspase- 3的活化和Bcl- 2蛋白表达降低。

植物甾醇抑制SGC-7901胃癌细胞生长和诱导DNA损伤的研究

为确定和评价植物甾醇对胃癌细胞SGC-7901生长的影响,采用MTT法检测植物甾醇对SGC-7901细胞生长的抑制作用,AO/EB和DAPI染色观察细胞形态的变化,单细胞凝胶电泳检测植物甾醇对SGC-7901细胞DNA的损伤。试验结果表明,植物甾醇对SGC-7901细胞生长具有抑制作用,并呈现时间-效应关系,不呈现剂量-效应关系;植物甾醇处理5d后,细胞出现皱缩、密度变小等变化;AO/EB荧光染色后,细胞核成固缩状,出现凋亡小体等凋亡细胞形态;DAPI染色后,可见细胞核边缘不整等凋亡细胞形态;单细胞凝胶电泳实验结果表明,植物甾醇混合物处理5d的细胞出现了彗星现象。植物甾醇对SGC-7901细胞生长具有抑制作用,诱导SGC-7901细胞DNA的损伤。

连花清瘟胶囊对乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制与诱导凋亡作用的观察

目的：研究连花清瘟胶囊抗肿瘤的药理作用。方法应用MTT法检测连花清瘟胶囊对乳腺癌 MCF－7细胞增殖的抑制程度，AO／EB双荧光染色法检测细胞凋亡形态，DNA琼脂糖凝胶电泳观察细胞 DNA 片段。结果在浓度为200～2667μg· mL －1内，连花清瘟胶囊对乳腺癌MCF－7细胞的增殖有显著的抑制作用，其抑制作用随药物浓度的增加而增强，对MCF－7细胞增殖抑制率由10．50％增加到43．83％，与对照组比较呈显著差异性（P＜0．05vs正常组）。连花清瘟胶囊明显影响乳腺癌MCF－7细胞的染色质，发生固缩等凋亡形态的变化及细胞凋亡的 DNA梯带形状。结论连花清瘟胶囊具有抑制乳腺癌细胞增殖和诱导其凋亡的抗肿瘤的药理作用。

龙葵碱对HepG2细胞线粒体膜电位及细胞内[Ca^2＋]i的影响

目的：观察龙葵碱对HepG2细胞线粒体膜电位及细胞内[Ca^2＋]i的影响，揭示龙葵碱诱导细胞凋亡的机制。方法：采用AO／EB双染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞形态学改变；TMRE单染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞线粒体膜电位的改变；Fluo-3／AM单染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内[Ca^2＋]i的改变；TMRE和Fluo-3／AM双染HepG2细胞，激光共聚焦扫描显微镜同时观察细胞线粒体膜电位和细胞内[Ca^2＋]i的改变。结果：形态学实验表明0．0032μg／mL、0．016μg／mL龙葵碱使细胞外周呈微弱皱缩状改变，0．08、0．4、2μg／mL龙葵碱使HepG2细胞出现大量碎片及凋亡小体等典型的细胞凋亡形态，即龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡；TMRE单染激光共聚焦测定表明龙葵碱能够降低HepG2细胞膜电位；Fluo-3／AM单染激光共聚焦测定表明龙葵碱能够升高肿瘤细胞内[Ca^2＋]。浓度；TMRE和Fluo-3／AM双染激光共聚焦观察表明龙葵碱在降低线粒体膜电位的同时能够升高细胞内[Ca^2＋]i浓度。结论：龙葵碱能够诱导HepG2细胞凋亡，其机制为降低HepG2细胞膜电位，开放细胞膜PT通道，使细胞内Ca^2＋顺浓度梯度转运，从而升高细胞内Ca^2＋浓度启动细胞凋亡机制。

氯化镉和氯化锌对V79细胞凋亡的影响

目的通过体外实验,以两种简便方法了解氯化镉(CdCl2)、氯化锌(ZnCl2)对中国仓鼠肺成纤维细胞(V79)细胞凋亡的影响.方法采用MTT法了解CdCl2对于V79细胞的毒性;在此基础上采用碱性单细胞凝胶电泳法和激光共聚焦技术结合AO/EB双染法,研究不同剂量CdCl2对V79细胞凋亡的影响,并采用生理浓度的ZnCl2与CdCl2同时作用后观察细胞凋亡情况.结果 MTT实验中,CdCl2对于V79细胞的毒性随染毒剂量增加而增强,呈线性关系;碱性单细胞凝胶电泳法和AO/EB双染法得到相似的结果,即1～32 μmol/L CdCl2可以引起V79细胞凋亡,凋亡率、凋亡指数分别为3.0%～49.6%及3.5%～53.8%,且随剂量增加而增大,呈剂量-效应关系;凋亡率、凋亡指数与CdCl2染毒浓度间可拟合成直线方程:y=0.931 5x-0.415 2.10 μmol/L ZnCl2可以拮抗CdCl2所致的凋亡效应.结论在本实验条件下,采用单细胞凝胶电泳和激光共聚焦技术均可以灵敏、快捷地检测CdCl2对于V79细胞的凋亡作用和锌对镉所致细胞凋亡的拮抗效应.

HMC毒素诱导玉米同核C、N细胞质细胞凋亡的荧光显微观察

【目的】研究玉米小斑病菌C小种毒素(HMC-toxin)诱导同核异质体玉米的离体根冠细胞发生凋亡的差异性及凋亡规律。【方法】采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染以及Hoechst 33258荧光染色的方法检测。【结果】HMC毒素诱导根冠细胞发生凋亡,出现凋亡小体与染色体边集形态特征。在3种毒素浓度、3种处理时间下,Mo17-C的根冠细胞死亡率均高于Mo17-N。采用AO与EB复染方法,在150μg.mL-1HMC毒素处理7 h时,Mo17-C细胞凋亡率达最高值,为68.7%,而Mo17-N仅为29%;经Hoechst 33258染色后,在150μg.mL-1HMC毒素处理下,Mo17-C也于7 h时达最大凋亡率,为57.3%,而Mo17-N为27.7%。【结论】在毒素"伤害"细胞致死过程中,C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质;在"诱导"细胞凋亡程序中,C细胞质的细胞凋亡率也远高于N细胞质的。凋亡率随诱导浓度和诱导时间的增加而增加。AO、EB复染与Hoechst 33258染色相比,两者细胞凋亡率接近,准确度均高,图像清晰,且费用相当,但前者可以区分早期和晚期凋亡细胞而后者不能区分。

非洲马铃果4种吲哚类生物碱的体外抗肿瘤效果

为比较非洲马铃果Voacanga africana 中长春胺、冠狗牙花定碱、老刺木胺、伏康京碱等4 种吲哚类生物碱的体外抗肿瘤活性,采用MTT 法分析其对SKOV3、BEL7402、SMMC7721、Changliver 四株细胞株增殖的抑制作用,并通过AO/EB 双染观察细胞凋亡的形态变化。结果显示,4 种吲哚生物碱对四株细胞株的增殖抑制现象存在剂量依赖关系。50 μg·mL^-1 老刺木胺对四株细胞株的生长抑制率均达95%以上;相同浓度下,伏康京碱仅对BEL7402、Changliver 的抑制率超过78%;冠狗牙花定碱仅对Changliver 有超过50%的增殖抑制率;长春胺对四株细胞株的增殖抑制效果不明显。经AO/EB 法染色后,四株细胞株在12.5 μg·mL^-1 老刺木胺的作用下呈现细胞核皱缩、浓聚和偏移的现象,说明老刺木胺具有明显诱导细胞凋亡的作用;50 μg·mL-1 伏康京碱仅对BEL7402 和Changliver 具有一样的效果,另两种生物碱作用的细胞株并未见有明显的细胞凋亡现象。MTT法和AO/EB 双染法表现结果一致。老刺木胺和伏康京碱两种生物碱能够诱导卵巢癌细胞和人肝细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用,长春胺和冠狗牙花定碱作用效果相对较弱。

蟾酥注射液诱导人膀胱癌细胞T24、BIU-87凋亡的研究

目的验证蟾酥注射液的抗癌活性。方法将T24细胞、BIU-87细胞分别接种于RPMI1640培养液中37℃孵育，并在多个时间点取细胞悬液加入AO／EB染料染色，在荧光显微镜下观察。结果在0、3、6、12、24和48h时，T24细胞的凋亡率分别为3．0％、12．5％、59．5％、66，5％、70．O％和63．5％，BIU-87细胞的凋亡率分别为2．0％、13．5％、55．5％、62．5％、68．5％和64．0％。结论蟾酥注射液可显著诱导T24细胞、BIU-87细胞凋广，在体外具有抗癌活性。

HMC毒素处理诱导玉米幼苗根冠细胞凋亡的结果观察

以玉米小斑病菌C小种毒素(HMC-toxin)分别诱导2对同核异质体玉米的幼苗根冠细胞(即:基因型为B37的玉米C型不育细胞质CB37和同核保持系NB37,基因型为Mo17的玉米C型不育细胞质CMo17和同核保持系NMo17),采用吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)荧光复染的方法,研究细胞发生凋亡的差异性及凋亡规律。结果表明:CB37的幼叶接种PBS再经150mg/L的HMC毒素处理后,其根冠细胞凋亡率达最高值为45.3%,而NB37仅为15.3%;CMo17凋亡率最高达63.7%,NMo17仅为6.39%;C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质,凋亡率随诱导浓度和诱导时间的增加而增加。HMC毒素诱导根冠细胞发生凋亡,活细胞核发出绿色荧光,坏死细胞核则呈现橙红色荧光,且细胞核呈松散的颗粒状或新月状,凋亡细胞则发出黄绿色或绿色荧光,染色体固缩成新月状或颗粒状。