转录因子AP-2β与SLP-2的蛋白相互作用

AP-2β是转录因子AP-2家族中的重要一员.AP-2是一个与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生都有密切联系的重要的转录因子家族.最近的研究表明,AP-2能通过与其他蛋白的相互作用来调控AP-2下游基因的转录活性.采用免疫共沉淀结合质谱鉴定的方法筛选与AP-2β相互作用的蛋白.结果筛选到Stomatin like protein2(SLP-2)蛋白可能与AP-2β相互作用.免疫共沉淀实验证实外源过表达和内源的SLP-2蛋白都能与AP-2β蛋白相互作用.而且,细胞免疫荧光实验发现外源表达的Myc-AP-2β蛋白与内源的SLP-2蛋白在MCF-7细胞的胞质中有共定位.此外,免疫印记实验结果表明过表达SLP-2能上调AP-2β的蛋白水平,这就表明SLP-2与AP-2β相互作用后,SLP-2可能使AP-2β蛋白更稳定.这些研究结果为进一步研究这两个基因的功能提供了新的切入点.

转录激活因子AP-2β基因的克隆、表达及其抗体的制备(英文)

目的 :克隆、表达与纯化出AP - 2 β蛋白质 ,并用所表达的蛋白质制备出抗AP - 2 β的抗体。方法 :将AP- 2 β基因插入到表达载体 pGEX - 4T - 1谷胱苷肽 -S -转移酶基因下游 ,所得克隆经测序 ,以确定其阅读框码的正确性 ,然后用正确的克隆质粒转化E .coliBL2 1,用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,而后用谷胱苷肽琼脂糖 - 4B纯化所表达的融合蛋白质。通过凝胶迁移率变动分析实验 (EMSA)测得蛋白质的生物学活性 ,所得蛋白质用于制备抗体。结果 :得到一条大约 78KD的蛋白质 ,并且成功的制备了抗体 ,所得蛋白质和抗体均具有很好的生物学活性。结论 :我们成功的表达出转录激活因子AP - 2 β并制备出抗AP - 2 β的抗体 ,为一下步对AP - 2 β的功能进行研究打下了良好的基础。

TFAP2A对肾小球硬化相关基因ADCK4转录调控机制的研究

目的探索细胞中TFAP2A对局灶节段性肾小球硬化(FSGS)相关基因含aarF结构域的激酶4(ADCK4)的转录调控机制及TFAP2A与ADCK4是否存在特定的结合区域。方法生物信息学分析肾小球硬化基因火山图,ADCK4及TFAP2A表达水平的关系。JASPAR数据库预测ADCK4基因转录起始位点-464 bp/+206 bp区域包含TFAP2A转录因子结合位点;TFAP2A siRNA浓度分别为5、10、15µmol/L,TFAP2A过表达质粒质量浓度分别为50、100、300µg/L,通过双萤光素酶报告基因实验验证TFAP2A对ADCK4基因启动子水平的调控作用。TFAP2A siRNA及TFAP2A过表达质粒转染细胞,实时荧光定量PCR检测TFAP2A、ADCK4 mRNA表达,蛋白免疫印迹实验检测TFAP2A、ADCK4蛋白表达。染色质免疫沉淀试验验证TFAP2A与ADCK4启动子的特定区域结合。结果生物信息学分析显示FSGS肾组织中RNA-Seq RNA表达上调的基因273个,表达下调的基因219个;ADCK4与TFAP2A表达水平呈正相关(P<0.01)。双萤光素酶报告基因实验证明TFAP2A siRNA浓度为10、15µmol/L的ADCK4启动子相对萤光素酶活性增强,TFAP2A过表达质粒质量浓度为100、300µg/L的ADCK4启动子萤光素酶活性降低(P<0.05)。与对照组相比,实验组ADCK4 mRNA和蛋白表达水平升高;过表达实验中,与对照组比较,实验组ADCK4 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。染色质免疫沉淀试验发现TFAP2A能与ADCK4启动子的特定区域结合。结论转录因子TFAP2A负向调控ADCK4基因表达,增加了调控足细胞重要基因的转录因子成员。

乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠乳腺组织病理形态学和AP-2α、C-erbB-2表达的影响

目的研究乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠乳腺组织病理形态学和AP-2α、C-erbB-2蛋白表达水平的影响。方法 36只大鼠随机分为正常对照组、疾病模型组、三苯氧胺软膏组、乳癖霜小、中、大剂量组。通过雌、孕激素联合制造乳腺增生病大鼠模型,造模的同时给予不同的药物进行干预。30 d后观察各组大鼠乳腺组织病理学和脏器系数的改变,放射免疫法检测各组大鼠血清性激素的水平,Western印迹法测定各组大鼠乳腺组织AP-2α蛋白的表达水平,免疫组化测定各组大鼠乳腺组织C-erbB-2蛋白的表达水平。结果乳癖霜外用能降低乳腺增生模型大鼠的乳头直径和高度,改善模型大鼠乳腺组织病理形态学改变,调节血清性激素水平,降低模型大鼠乳腺组织中转录因子AP-2α、癌基因C-erbB-2蛋白的表达水平,与模型组比较有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结论乳癖霜外用对乳腺增生模型大鼠有显著的疗效,其作用机制可能为调节血清性激素水平及调节大鼠乳腺组织转录因子AP-2α、原癌基因C-erbB-2蛋白的表达水平。

子痫前期胎盘组织中AP-2α与滋养细胞凋亡、侵袭的相关性研究

目的:探讨子痫前期胎盘组织中AP-2α与滋养细胞凋亡、侵袭的相关性。方法:选取2015年11月～2017年10月间在本院分娩的子痫前期产妇68例作为子痫前期组,另取同期在本院进行分娩的健康产妇60例作为正常对照组。对比两组胎盘组织中AP-2α基因、凋亡相关基因、侵袭相关基因表达量的差异,进一步分析子痫前期胎盘组织中AP-2α基因表达量与滋养细胞凋亡、侵袭活性的内在联系。结果:子痫前期胎盘组织中AP-2αmRNA的表达量高于正常对照组;凋亡相关基因Bcl、Cx43 mRNA的表达量低于正常对照组,Bax、Caspase7、metastin mRNA的表达量高于正常对照组;侵袭相关基因HIF-1α、GPR30、MEST、Snail mRNA的表达量低于正常对照组,PEDF、RECK mRNA的表达量高于正常对照组(P<0.05)。Pearson检验发现,子痫前期胎盘组织中AP-2α基因表达量与滋养细胞凋亡相关基因、侵袭相关基因表达量均直接相关。结论:子痫前期产妇胎盘组织中AP-2α基因表达量异常增高,可正向调控滋养细胞的凋亡活力并负向调控其侵袭活力。

一类新的AP-2α转录共激活物Ku 70蛋白的鉴定

目的鉴定新的AP-2α转录共激活物,为乳腺癌的防治寻找新的靶点。方法以AP-2α为诱饵采用酵母双杂交技术寻找新的AP-2α结合蛋白,免疫共沉淀证实AP-2α与其结合蛋白的相互作用,免疫荧光技术检测AP-2α与其结合蛋白的亚细胞共定位。荧光素酶报导基因检测AP-2α结合蛋白对AP-2α转录活性的影响。结果酵母双杂交技术鉴定出Ku70蛋白为新的AP-2α结合蛋白。免疫共沉淀证实了AP-2α和Ku70蛋白在细胞内的相互作用。亚细胞共定位研究显示AP-2α和Ku70蛋白都定位于细胞核内。在功能上发现Ku70可以增强AP-2α的转录活性。结论本研究首次揭示Ku70可以结合AP-2α并促进其转录活性,证明Ku70是一类新的AP-2α的转录共激活物,提示Ku70有望成为治疗AP-2α高表达乳腺癌的新靶点。

乳腺癌中转录因子AP-2的表达及其与c-erbB-2表达的相关性

目的探讨转录因子AP-2在乳腺癌中表达及其与c-erbB-2表达的相关性。方法应用免疫组织化学染色技术(SP法)检测128例乳腺癌组织中AP-2和c-erbB-2的表达。结果c-erbB-2和AP-2在128例浸润性导管癌中过表达率分别为30.46%(39/128)和34.38%(44/128)。对照组乳腺增生病与乳腺癌组织中AP-2的过表达率有显著差异(χ2=6.91,P<0.01)。乳腺癌中AP-2的过表达与患者年龄(χ2=2.3,P>0.05)、肿块大小(χ2=2.58,P>0.05)及淋巴结转移(χ2=0.32,P>0.05)无关,而与肿瘤组织学分级有关。在组织学分级I、II、III级肿瘤组织中AP-2(χ2=7.46,P<0.05)的过表达均有显著差异,且随着组织学分级的增高,AP-2的过表达率也相应增加。128例乳腺癌中c-erbB-2和AP-2的过表达具有相关性(r=0.87,P<0.01),且呈正相关关系(0<r<1)。结论AP-2在乳腺癌组织中存在过表达,与c-erbB-2一样可作为判断预后或选择化疗用药的指标。

转录因子AP-2α对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:研究转录因子活化蛋白-2α(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及其相关机制。方法:构建pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒,利用脂质体分别介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α和空质粒pcDNA3.1(+)转染SW480细胞,以正常SW480细胞作为空白对照;采用RT-PCR和Western印迹法检测转染48h后各组细胞中AP-2α的表达水平;采用电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测转染重组质粒后SW480细胞表达的AP-2α是否具有DNA结合活性;用MTT法研究AP-2α基因转染24、48、72h后SW480细胞的增殖情况;采用流式细胞术分析各组的细胞周期变化,Western印迹法检测细胞内p21/WAF1的表达水平。结果:转染pcDNA3.1(+)-AP-2α重组质粒48h后,SW480细胞内AP-2αmRNA含量以及蛋白水平均显著升高,并且具有较强的DNA结合活性;MTT结果提示,转染AP-2α基因后SW480细胞增殖趋缓;细胞周期分析结果提示,转染AP-2α基因48h后G0/G1期细胞比例较正常细胞增加(P<0.05);转染AP-2α基因48h后,SW480细胞内p21/WAF1表达增加。结论:AP-2α可抑制SW480细胞的增殖,其抑制作用很可能与激活p21/WAF1表达有关。

癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达

目的探讨癌基因DEK与转录因子AP-2α在乳腺癌变中的相互作用及在HER2过量表达、乳腺癌变中的病理学意义。方法用Western blot检测组织中DEK、AP-2α和HER2蛋白水平之间的相关性;免疫共沉淀检测DEK和AP-2α在MDA-MB-453乳腺癌细胞中的相互作用;通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中DEK和AP-2α的表达,用半定量RT-PCR和Western blot检测HER2的表达。结果乳腺癌组织中DEK、AP-2α和HER2的蛋白水平之间显示一定的相关性,DEK和AP-2α在MDA-MB-453细胞内有相互作用,siRNA抑制DEK和AP-2α的表达可协同抑制MDA-MB-453细胞中HER2mRNA和蛋白的表达。结论癌基因DEK和转录因子AP-2α协同促进乳腺癌中HER2的高表达。

AP-2α对大肠癌细胞侵袭生长及ER-β表达的影响

目的:研究转录因子激活蛋白-2α基因(transcription factor activator protein-2α,AP-2α)对大肠癌SW620细胞侵袭生长的影响,并探讨其对雌激素受体β基因(estrogen receptor-β,ER-β)表达的影响及其可能的分子机制。方法:利用脂质体介导重组质粒pcDNA3.1(+)-AP-2α与空质粒pcDNA3.1(+)转染入SW620大肠癌细胞,采用基质胶黏附实验与Transwell实验检测细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移能力,采用实时定量PCR、Western blotting、免疫荧光细胞化学检测细胞中AP-2α和ER-β在基因和蛋白水平的表达,以电泳迁移率分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)方法检测转染AP-2α基因后肿瘤细胞中AP-2α的DNA结合活性及其与ER-β的结合能力。结果:AP-2α转染SW620细胞后抑制了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力(均P<0.05);同时细胞中ER-β基因的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);EMSA结果显示,AP-2α转染的SW620细胞中表达的AP-2α蛋白与ER-β基因启动子区域发生特异性结合。结论:AP-2α转染SW620细胞可显著抑制大肠癌SW620细胞体外黏附、侵袭与迁移能力,其分子机制很可能与AP-2α直接作用于ER-β基因启动子区域从而影响ER-β基因的表达有关。

转录因子OCT-4对靶基因AP-2γ表达调控的研究

OCT-4和AP-2γ是近年来睾丸生殖细胞瘤诊断过程中研究的热点基因.作为一个在胚胎发育中起着重要作用的转录因子,OCT-4基因在发育的不同时期、不同分化过程中发挥着多种生物学功能,其作用是通过对靶基因的调控来实现的.本研究运用多种软件分析,发现AP-2γ启动子区域的序列部分有OCT-4的结合位点.利用CHIP-PCR方法鉴定AP-2γ是OCT-4调控的靶基因.应用Luciferase assay、免疫荧光实验、小鼠隐睾模型等实验进行验证,OCT-4基因抑制AP-2γ转录活性和影响其蛋白质水平的表达.这一新发现,有利于从分子水平上研究睾丸生殖细胞瘤的发生机制.

精原细胞瘤中M2A、AP-2γ、OCT3/4、PLAP和CD117的表达及其意义

目的:检测精原细胞瘤中M2A、AP-2γ、OCT3/4、PLAP和CD117的表达情况,探讨这些标记物在该肿瘤病理诊断及鉴别诊断中的意义。方法:采用免疫组化SP法,检测40例睾丸精原细胞瘤中M2A、AP-2γ、OCT3/4、PLAP和CD117的表达情况。结果:M2A、AP-2γ、OCT3/4、PLAP和CD117阳性表达率分别为95.0%、87.5%、72.5%、67.5%和75.0%,在13例PLAP表达阴性的精原细胞瘤中M2A和AP-2γ的阳性表达率分别为84.6%和76.9%。M2A、AP-2γ表达与OCT3/4、PLAP、CD117的表达比较,差异有显著性;M2A与AP-2γ表达之间比较,差异无显著性,OCT3/4、PLAP与CD117间比较,差异也无显著性。结论:精原细胞瘤中M2A、AP-2γ高水平表达,可以作为诊断精原细胞瘤、特别是PLAP标记阴性的精原细胞瘤的免疫组化标记物,可作为鉴别诊断的有用指标。

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。

转录因子AP-2α与TES蛋白相互作用分析

为研究转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用机制,分别构建AP-2α与GST的融合蛋白原核表达载体及TES与His的融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌E.coli BL 21中诱导表达,表达产物经纯化后用GST Pull-down及免疫印迹技术分析其相互作用关系.实验结果表明,AP-2α与TES之间存在相互作用是由于AP-2αC端能与TES C端的首个LIM结构域结合,酵母双杂交实验也证实了该结果;同时根据AP-2α只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提出了TES蛋白存在自身相互作用的可能,这种自身折叠封闭了位于TES C端首个LIM结构域上的AP-2α结合位点.

RNAi干扰AP-2α对人乳腺癌细胞HER2表达及细胞增殖的影响

目的探讨RNAi干扰转录因子AP-2α对乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2表达及细胞增殖的影响。方法通过siRNA抑制MDA-MB-453细胞中AP-2α的表达,采用半定量RT-PCR和Western blot法,检测其对HER2表达的影响,采用MTT法测定细胞增殖情况。结果siRNA抑制AP-2α表达后,HER2 mRNA及其蛋白水平显著下降,RNAi干扰组与对照组比较MDA-MB-453细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论AP-2αsiRNA可以下调乳腺癌细胞MDA-MB-453中HER2 mRNA及其蛋白的表达水平,抑制MDA-MB-453细胞的生长,提示AP-2α基因在乳腺癌细胞的发生、发展中具有重要作用,AP-2α可能是HER2过量表达乳腺癌的治疗靶点。

AP-2α对人肺腺癌细胞 COX-2表达的作用研究(英文)

目的探讨核转录因子激活蛋白2α(AP-2α)对A549细胞环氧合酶2(COX-2)表达的作用。方法将AP-2α腺病毒载体转染入A549细胞,观察AP-2α对A549 细胞COX-2 表达及白介素1β(IL-1β)诱导A549细胞 COX-2表达的影响。将AP-2突变质粒载体转染入A549细胞,观察AP-2突变体对IL-1β诱导A549细胞 COX-2表达的影响。用Western印迹检测COX-2蛋白的表达。结果AP-2α增加 A549 细胞 COX-2表达及IL-1β诱导的A549细胞COX-2表达。AP-2突变体降低IL-1β诱导的A549细胞COX-2表达。结论AP-2α上调A549细胞COX-2的表达。

转录因子AP-2beta和p53蛋白相互作用的研究

转录因子p53与AP-2基因家族成员AP-2beta发生突变后,均会导致个体出现相应的疾病。本文首先利用两个重组质粒p CMV-HA-p53和p Myc-AP-2beta,转染永生化的胚胎肾细胞HEK293(野生型),在细胞中表达相应蛋白质。通过免疫共沉淀实验证明AP-2beta和p53蛋白在体内可以相互作用。并将梯度增加的p MycAP-2beta质粒及等量p CMV-HA-p53质粒转染到HEK293细胞,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明AP-2beta能正向调控p53蛋白的表达。为了进一步探讨AP-2beta与p53的作用机制,利用蛋白质合成抑制剂CHX(cycloheximide)处理转染了AP-2beta与p53表达质粒的细胞,实验结果说明,AP-2beta能增加p53蛋白的稳定性来调控p53的表达。

转录因子AP-2α与ACTN1、TES的相互作用

AP-2α是转录因子AP-2家族中的重要一员,与发育和细胞生长、分化和凋亡都有密切的联系.本文用酵母双杂交的方法筛选得到两个与转录因子AP-2α相互作用的蛋白,经测序鉴定分别为ACTN1与TES基因.在先前对AP-2α与TES基因分别克隆并在表达的基础上,进一步克隆并表达了ACTN1基因,并证实了ACTN1蛋白与AP-2α能够在体外相互作用.而且免疫共沉淀的结果表明在HeLa细胞系中过表达的AP-2α与TES蛋白能够处于同一复合体中.同时发现HeLa细胞系中,内源表达的ACTN1蛋白与GFP-TES有明显的共定位.结果提示这3种蛋白可能存在于同一个大的复合体中,通过这样的结合完成复杂的调节功能.

转录因子AP-2α对HeLa细胞内14-3-3σ表达的影响

目的探讨转录因子AP-2α对HeLa细胞内14-3-3σ表达的影响。方法在HeLa细胞内过表达AP-2α或干扰AP-2α的表达,用荧光定量RT-PCR和Western blot检测Hela细胞AP-2α和14-3-3σ的表达量;采用计算机软件预测14-3-3σ的启动子区域的转录因子结合位点;采用双荧光素酶报告基因分析试验验证AP-2α对14-3-3σ启动子转录活性的影响。结果在HeLa细胞内过表达AP-2α后,14-3-3σ的mRNA和蛋白表达水平增高,而用siRNA干扰AP-2α后,14-3-3σ的mRNA和蛋白表达水平降低;软件分析结果显示在14-3-3σ启动子区域存在多个潜在的AP-2α结合位点;双荧光素酶报告基因分析试验证明在HeLa细胞内,AP-2α增强14-3-3σ启动子的转录活性。结论 AP-2α正调控HeLa细胞内14-3-3σ的表达,这种调控作用可能是通过AP-2α增强14-3-3σ启动子的转录活性来完成的。

AP-2γ基因的克隆、表达及其部分生物活性的测定

AP 2γ基因是AP 2基因家族中非常重要的转录激活因子 ,它对脊椎动物的胚胎发育起着十分重要的作用 ,并与细胞的生长及癌变有一定的联系。将人的AP 2γ基因插入表达载体GST系统中的pGEX 4T 2的谷胱苷肽 S 转移酶基因下游 ,转化E .coliDH5α ,鉴定挑选出阳性菌落并扩大培养 ,提取重组质粒进行DNA测序 ,确定其阅读框码的正确性。再将正确的重组质粒转化E .coliBL2 1 ,用异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导后 ,在Tac启动子作用下 ,表达出一条 81kDa的蛋白质带 ,所得蛋白质用谷胱苷肽琼脂糖 4B纯化后 ,得到融合蛋白质 ,通过凝胶迁移率变动分析和免疫印迹分析实验 ,测得该蛋白质的部分生物活性 ,结果表明 ,它具有很好的生物学活性 ,为进一步对AP