墨兰CsAP1-A基因克隆及表达分析

【目的】AP1基因在植物的花器官发育和开花调控中发挥重要作用,对墨兰AP1基因进行克隆与表达分析可为研究其在墨兰花发育和开花调控中的作用提供前期基础。【方法】以墨兰品种‘小香’为材料,克隆到1个AP1基因,命名为CsAP1-A。通过生物信息学分析其基因结构、蛋白结构域和进化关系,利用RTqPCR方法分别检测CsAP1-A在墨兰不同器官、不同花发育阶段和不同花组织部位的表达情况;通过转录组测序分析CsAP1-A在5个不同花型墨兰品种花组织部位的表达情况;通过蛋白互作预测软件分析CsAP1-A与其他蛋白的互作关系。【结果】CsAP1-A基因编码区为744 bp,编码248个氨基酸,含有高度保守的MADS-box和K-box结构域,符合MADS-box转录因子家族特征。CsAP1-A与其他兰科植物AP1蛋白相似性较高,其中与春兰AP1/FUL3(APY18447.1)和蕙兰MADS1(AGE15496.1)的同源性最高。RT-qPCR分析结果表明,CsAP1-A在墨兰不同器官中均有表达,在花中表达量最高,且集中在花芽分化初期(S1)高表达。在不同花型的墨兰品种中,CsAP1-A在WT(普通型)、MPV(重瓣花型)、LaPV(花瓣唇瓣化花型)和NLV(唇瓣萼片化花型)4种花型的合蕊柱中表达量均最高,而在萼片中表达量最低;在合蕊柱异常发育的MPV中,CsAP1-A在合蕊柱的表达量显著提高,而在花瓣蕊柱化的梅瓣花型(GPV)中整体表达量最高,且表达区域从合蕊柱扩展到花瓣。蛋白互作预测CsAP1-A蛋白可与MADS1、MADS6、MADS47、MADS8等10个蛋白存在互作关系。【结论】墨兰CsAP1-A的基因结构、进化关系、时空表达情况和蛋白互作预测可为墨兰花发育的研究提供理论依据,对进一步揭示CsAP1-A基因在墨兰成花过程中的作用奠定基础。

山核桃APETALA1同源基因的克隆与序列分析

根据植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1(AP1)基因的高度保守区序列,设计合成一对长度为23 bp的聚合酶链式反应(PCR)引物,以山核桃Carya cathayensis基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为486 bp的DNA片段,克隆到pMD18-T载体。测序和序列分析结果表明,获得了山核桃AP1同源基因中的1个片段,该片段序列包含2个内含子,长度分别为86 bp和291 bp,编码区共编码36个氨基酸。其序列已在GenBank中注册(注册号为EU155118),在GenBank中进行同源性检索结果表明,其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达69%～88%,推测它们在功能上也是相似的。

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分生组织及花器官形成过程中起重要作用的APETALA1(AP1)基因的保守区序列 ,设计 1对长度为 2 3bp的PCR引物 ,以毛叶枣基因组DNA为模板 ,采用PCR方法扩增出长为 648bp的DNA片段 ,克隆入pUCm T载体 ,测序和序列分析结果表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的 1个片段 ,该片段有 2个内含子 ,长度分别为15 2bp和 386bp ,编码区共编码 36个氨基酸 ,其序列已在GenBank中登记 (登记号为AF35 65 41) .在GenBank中进行同源性检索 ,结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达 66 %～ 88% 。

普通枇杷和栎叶枇杷APETALA1同源基因的克隆和序列分析

分析植物花分生组织特征基因APETALA1(AP1)同源基因的保守区序列,设计特异引物;用PCR方法从枇杷栽培品种香钟11号和野生种栎叶枇杷基因组DNA中各扩增出1个350 bp左右的片段;将该片段分别克隆到pUCm-T载体.测序和序列分析结果表明获得了枇杷AP1同源基因的片段.该基因片段的序列在2个不同种的枇杷间差异较小,均含有2个内含子,特别是外显子部分只有1个碱基的差别;编码区共编码36个氨基酸,氨基酸序列也只有1个氨基酸的差异.其序列已经在GenBank中登记(登录号分别为AY549306和AY571786).同源性比较发现该基因片段与其他作物中已经报道的AP1同源基因的同源性大都在80%以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到91%(栽培种)和94%(野生种),推测它们具有相似的功能.

花分生组织决定基因APETALA1转化油菜

拟南芥的APETALA1(AP1)是花分生组织的决定基因,同时也是萼片和花瓣正常发育的控制因子。本研究构建了含有AP1基因的植物表达载体PCAP,启动子为CaMV35S,通过农杆菌侵染法转化油菜。用PCR方法对转基因植株进行了DNA和RNA水平上的分子检测,证明AP1基因已经整合到转基因植株的基因组中,并且得到了有效的表达。获得的转基因植株也表现出提前开花的特性。试验结果表明,AP1基因在促进成花方面的关键作用不具有种属特异性,利用基因工程可以快速高效地进行油菜早熟性的遗传改良。

拟南芥APETALA1基因在花发育中的网络调控及其生物学功能

为了阐明拟南芥花分生组织特征基因——APETALA1(AP1)基因在开花调控网络的中心位置,笔者重点综述了AP1在花发育中的网络调控及其生物学功能,探讨了花发育机制的研究重点。AP1既是花分生组织决定基因,也是花器官发育特征基因,处于成花调控网络的关键位置。AP1基因需要通过与其他调控基因的相互作用,决定花分生组织的形成、花芽的起始及花器官的发育。

芍药AP1(APETALA1)基因密码子使用的偏好性分析

在前期克隆芍药AP1基因(登录号为KC354376)的基础上,运用CHIPS、CUSP和Codon W在线程序,分析芍药AP1基因的密码子偏好性,并与其他物种的AP1基因以及模式生物的基因组进行比较。结果表明,芍药AP1基因大部分偏好使用以A/T结尾的密码子,29种偏好密码子(RSCU值>1)中,偏好性较强的有CCA、AGG、TCA、GTT(RSCU值≥2);通过比较12种植物的AP1基因密码子偏好性,发现AP1基因在芒果和梨中的表达水平相对较高,而在芍药和牡丹等植物中的表达水平一般,并且大多偏好以A/T结尾的密码子,这可能与该基因的特殊功能有关;聚类分析结果表明,芍药科中芍药与牡丹聚为一类,梨和碧桃聚为一类;在密码子的使用频率上,芍药AP1基因与酵母基因组的差异小于与大肠杆菌和拟南芥基因组的差异,酵母真核表达更适合作为芍药AP1基因的外源表达系统。本研究结果可为芍药AP1基因在遗传改良中选择合适的受体植物、选择较佳的外源表达系统以及提高该基因的表达水平提供参考依据。

芒果AP1同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个A州同源基因全长cDNA，分别命名为MAPl—1（GenBankac—cession No．FJ529206）和MAPl—2（GenBankaccession No．FJ529207）。MAPl—1编码247个氨基酸，开放阅读框长度为741bp，蛋白质分子量为28．54kD，等电点为8．31；MAPl—2编码248个氨基酸，开放阅读框长度为744bp，蛋白质分子量为28．78kD，等电点为8．70。同源性分析表明，它们的核苷酸序列与其它木本植物A纠同源基因的一致性为72％～81％。实验分析表明，MAPl—1和MAPl—2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域，第88至第178个为K盒结构域；两个基因均定位于细胞核，且功能位点分布存在着不同，推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异。蛋白二级结构预测显示，MAPl—1蛋白有12个α-螺旋，4个8折叠区，14个β-转角；而MAP1—2蛋白有11个α-螺旋，5个B折叠区，15个β-转角；其大多数氨基酸具有亲水性。本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段。

Y系山定子AP1同源基因的克隆及序列分析

以Y系山定子为试材研究AP1基因,试图为缩短果树童期提供理论依据。根据已登录的苹果AP1基因保守序列设计引物,以Y系山定子的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得1 010 bp的基因片段;PCR产物纯化后,将其连接到pMD18-T载体上,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞,通过蓝白斑筛选、质粒长度和酶切鉴定,获得重组质粒并测序。测序结果表明,该序列有2个外显子、1个内含子及2个内含子的一部分,编码区共编码81个氨基酸;对氨基酸序列保守性分析发现,第13-81个氨基酸为MADS-box基因家族特有的K区域;其氨基酸序列在GenBank中同源性检索表明,Y系山定子与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性为67.9%-100%。研究结果为揭示Y系山定子早花现象的分子机制奠定了基础,对果树育种具有重要的理论价值和实际意义。

AP1基因转化地被菊品种‘玉人面’的研究

The flower’s meristematic characteristic gene AP1 was introduced into Chrysanthemum morifolium cv. ‘Yu Ren Mian’ mediated by Agrobacterium tumefaciens.The factors influencing genetic transformation protocol were studied.The results showed that the leaf explants precultured for 2～8 hours or not precultured were best for transformation by A. tumefaciens. The suitable concentration of bacterial and the time for infecting was OD_ 600 0.5 for 10 minutes. Leaves were cocultivated with bacterial at 23～25 ℃ for 2 days,then delayed selection for 3 days. Kan^r plant were selected by increased selective press from 5 mg·L ~ -1 G418 to 7.5 mg5L~ -1 G418 followed by 10 mg5L~ -1 G418. The integration of AP1 gene into C. morifolium ‘Yu Ren Mian’ was confirmed by PCR and Southern blotting.Two of transgenic plants bloomed 15 days earlier than untransformed plants.

无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育

为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系,将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因(HPT)分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中,并经农杆菌介导,将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中,获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明,AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中,并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察,选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系;抗病性鉴定结果表明,转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高,部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓(Fragaria×ananassa)中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。

花分生组织决定基因AP1转化矮牵牛的研究

利用RT_PCR方法从拟南芥 (Arabidopsisthaliana (L .)Heynh .)中克隆了花分生组织决定基因 (flower_meristem_identitygene)AP1,进行了全序列测定。测序结果显示 ,所得到的基因与发表的序列仅有一个碱基的差异 ,但并不影响蛋白质的一级结构。将AP1基因克隆入植物中间载体p2 0 8,通过根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)介导的方法转化矮牵牛 (PetuniahybridaVilm .)。对转基因植株进行了PCR和Southern检测 ,所得到的两个株系的转基因矮牵牛在R0 代即表现出提前且持续不断地开花的特性 。

萼脊兰SeAP1-like基因的克隆与表达载体构建

根据NCBI网站上萼脊兰AP1-like全长基因序列设计引物,采用RT-PCR法从萼脊兰花瓣中扩增Se AP1-like基因,对扩增产物进行克隆和测序。结果表明,获得的萼脊兰Se AP1-like基因为743 bp,编码247个氨基酸。将Se AP1-like基因插入p CAMBIA1304载体中,经PCR、双酶切鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体p CAMBIA1304-Se AP1。对Se AP1-like基因的结构域和所表达蛋白质的亲水性进行了分析,并预测了该基因所表达蛋白的二维结构。结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守域,属于MADS-box基因家族,该蛋白分子属于亲水性蛋白。二级结构分析表明,其包含57.49%的α螺旋、6.07%的延伸链、36.44%的不规则折叠。

中国汉族人群不明原因猝死与NOS1AP基因多态性的相关性

目的研究日常活动中不明原因猝死(sudden unexpected death,SUD)者NOS1AP基因的单核苷酸多态性。方法收集60例一般日常活动中SUD病例心血样本作为SUD组,另外随机抽取80例无关个体的外周血样本作为对照组,提取基因组DNA,用特异性引物对NOS1AP部分SNP位点(rs10494366、rs10918859、rs12143842、rs12742393、rs3751284、rs348624)进行PCR扩增和直接测序,计算等位基因频率和基因型频率,并分析各SNP位点在SUD组与对照组之间的差异性。结果 NOS1AP第6外显子区域的rs3751284位点的等位基因频率和基因型频率在两组人群中的差异均有统计学意义(P<0.05)。rs3751284位点的最小等位基因的频率在SUD组为0.325,在对照组为0.475。结论 rs3751284位点可能是SUD的易感基因位点。

芥菜AP1基因体外表达及其与FLC相互作用的验证

芥菜花分生组织决定因子AP1与开花路径核心调节子FLC可能存在直接的相互作用,从而调节开花时间。为进一步检测该相互作用,从芥菜"QJ"材料中同源克隆了790bp的AP1cDNA序列,该基因编码256个氨基酸。生物信息学分析表明,AP1属MIKC型蛋白,其MADS域含有2个螺旋和2个折叠,第1个螺旋内含有1个不保守氨基酸位点;而K域含有3个螺旋,第1、2个螺旋内各有1个不保守位点,第3个螺旋内具有4个不保守位点。同时构建了原核表达质粒pET43.1a-AP1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,以IPTG诱导该融合蛋白体外表达。利用pET43.1a-AP1融合蛋白序列中6×His标签与Ni+结合的特点,结合SDS-PAGE分析,证实了体外表达蛋白AP1能与FLC相互作用并形成复合体,该结果为深入研究AP1与FLC互作机制及花分生组织的分子调控奠定了基础。

植物AP1基因研究进展(综述)

AP1(APETALA1)基因属于植物花分生组织特征基因和花器官形态特征基因,在控制植物花分生组织特性与花器官的形成过程中起着重要的作用。本文综述了近年来植物AP1基因结构、功能、表达调节及其与物种进化关系研究的新进展,并对其在果树上的应用研究进行分析和展望。

新疆核桃AP1同源基因部分片段的克隆与表达分析

为了分离新疆早实核桃上与花分生组织相关的基因,以早实核桃的花芽为实验材料,通过对不同植物的AP1保守区核苷酸序列分析,设计1对引物,采用RT-PCR的方法克隆获得1条长度为463bp的PCR产物,命名为JrAP1。该片段与其他植物的AP1同源基因序列同源性达70%～86%,推测所得的基因为AP1基因的同源基因对其全长和功能将进行进一步研究分析。初步RT-PCR分析的结果表明:JrAP1在早实核桃的顶芽、花芽、枝条、果实、老叶、嫩叶上都有表达,说明了该基因参与了早实核桃的营养生长和生殖生长。而且其在新疆早实核桃及晚实核桃上都能够得到表达,扩增产物亮度早实核桃>晚实核桃,推测其可能在早实机制上起到一定的作用。

莲瓣兰大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系统发育分析

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来,人们对经典的ABC模型进行了改进和完善,提出花发育的ABCDE模型,通过RT-PCR和RACE技术从莲瓣兰大雪素花器官中克隆得到AP1同源基因AP1a和AP1b的cDNA全长:AP1a基因全长为1 054bp,其开放阅读框为744bp;AP1b基因全长为944bp,其开放阅读框为516bp。从莲瓣兰大雪素中得到2个AP1同源基因,说明在大雪素中AP1出现基因松弛,所以出现多个拷贝。通过序列比对以及系统发育分析表明,莲瓣兰AP1a基因与春兰具有很高的相似度,达到99.1%,莲瓣兰AP1b基因与萼脊兰具有中等程度的相似度,达75.8%,但从大雪素花器官提取的同源基因AP1a和AP1b的相似度很低,仅为65.4%。这表明AP1基因在不同品种植物间具有保守性,而在同一个物种中又存在着功能的分化。