APC/β-catenin/TCF通路在奥曲肽调控结肠癌SW480中的分子机制

目的:研究奥曲肽(Octrotide,OCT)对结肠癌SW480细胞中APC/β-catenin/TCF通路各热点分子在mRNA水平和蛋白水平表达量的影响,初步探讨OCT调控SW480细胞APC/β-catenin/TCF通路的分子靶点.方法:(1)mRNA检测:体外培养人结肠癌SW480细胞,分为对照组和OCT组(10-10mol/L),分别提取两组细胞的总RNA,以RT-PCR法检测APC2、AXIN、CK1α、CyclinD1、FZD7的mRNA,筛选出两组细胞5个基因mRNA的表达差异;(2)蛋白检测:体外培养人结肠癌SW480细胞,分为对照组和OCT1、2、3组(10-14、10-12、10-10mol/L),分别提取4组细胞的总蛋白,以Western blot法检测APC2、CK1α、CyclinD1的蛋白质,鉴定4组细胞中3个基因在蛋白水平的表达差异.结果:(1)mRNA检测:OCT组(10-10mol/L)中APC2、CK1α的mRNA表达上调(均P<0.05),CyclinD1的mRNA表达下调(P<0.05),AXIN和FZD7的mRNA改变无统计学意义(P>0.05);(2)蛋白检测:OCT1、2、3组中APC2、CK1α蛋白表达上调(P<0.05),CyclinD1蛋白表达下调(P<0.05),且呈浓度依赖性.结论:OCT通过强化APC2、CK1α"负反馈"调节作用,下调靶基因CyclinD1,负性调控结肠癌SW480中APC/β-catenin/TCF通路.

Wnt信号通路成分β-catenin和APC在卵巢肿瘤中的表达及意义

目的:探讨Wnt信号通路成分β-catenin和APC基因在上皮性卵巢癌的表达及意义。方法:应用免疫组织化学染色SABC法检测49例卵巢癌(24例浆液性囊腺癌、15例黏液性囊腺癌、10例子宫内膜样癌),10例交界性卵巢肿瘤及16例良性卵巢肿瘤中β-catenin、APC基因的表达,分析其相关性。结果:卵巢癌中β-catenin的异常表达率明显高于卵巢交界性肿瘤和卵巢良性肿瘤,差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢癌中APC基因的阴性表达率明显高于卵巢良性肿瘤,差异有统计学意义(P<0.05),而与卵巢交界性肿瘤无显著差异(P>0.05)。卵巢癌中APC基因的阴性表达与β-catenin的异常表达无相关性(r=0.0429,P>0.05)。2例卵巢子宫内膜样癌中可见β-catenin胞核表达,但不伴有APC基因的阴性表达。结论:卵巢癌中Wnt信号通路中的成分发生变化,但其激活机制可能有别于Wnt信号通路的传统激活机制,可能在卵巢子宫内膜癌的发生中发挥作用。

经典Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在1型糖尿病心肌病中的作用

目的 探讨Wnt/β-catenin/TCF7L2信号通路在1型糖尿病小鼠心肌病中的作用。方法利用7~8周龄♂C57BL/6小鼠腹腔注射链脲佐菌素,建立1型糖尿病模型,糖尿病小鼠成模4周后,随机分为糖尿病组、β-catenin通路抑制剂iCRT14(2.5、5 mg·kg^-1)组。连续腹腔给药8周后,HE染色检测心脏细胞形态;免疫组化及Western blot检测β-catenin、TCF7L2蛋白表达;荧光定量PCR检测β-catenin、Tcf7l2、Nppa、c-Myc mRNA表达。结果糖尿病组心肌细胞排列相对紊乱、细胞核大小不规则;Western blot和免疫组化结果显示,糖尿病组小鼠心脏β-catenin、TCF7L2表达升高,心肌细胞核内β-catenin、TCF7L2表达明显增多;qPCR显示,β-catenin/TCF7L2通路下游基因c-Myc、心肌肥大基因Nppa表达上调。iCRT14组小鼠心肌细胞排列相对规则,形态趋于正常;β-catenin、TCF7L2蛋白表达降低,核内表达减少;肥大基因Nppa、下游基因c-Myc mRNA表达明显减低。结论 Wnt/β-catenin/TCF7L2通路活化在糖尿病心肌病发生、发展中发挥重要作用,β-catenin抑制剂能明显减缓1型糖尿病小鼠心肌病的进程。

基于β-catenin/TCF4信号通路探究miR-455-3p对人结肠癌细胞增殖、凋亡及糖酵解的影响

目的基于β-catenin/TCF4信号通路探究miR-455-3p对人结肠癌细胞增殖、凋亡及糖酵解的影响。方法HCT116细胞转染miR-455-3p mimics为miR-455-3p转染组,HCT116细胞转染miR-455-3p NC为miR-NC组,HCT116细胞不转染任何质粒为空白组。MTT法检测各组HCT116细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况;检测各组细胞糖酵解葡萄糖摄取量和乳酸生成量;Western blotting检测各组细胞中HK2、β-catenin、TCF4蛋白水平。结果空白组和miR-NC组细胞中miR-455-3p表达量分别为0.99±0.09和1.01±0.10,均低于miR-455-3p转染组的1.82±0.12,差异具有统计学意义(P<0.05)。空白组和miR-NC组48 h吸光值(A)分别为0.75±0.05和0.78±0.06,均高于miR-455-3p转染组的0.32±0.02,差异具有统计学意义(P<0.05)。空白组和miR-NC组细胞凋亡率分别为(2.35±0.6)%和(2.46±0.5)%,均低于miR-455-3p转染组的(22.6±2.1)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。和空白组比较,miR-455-3p组细胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量均显著降低(P<0.05)。和空白组比较,miR-455-3p组细胞中HK2、β-catenin和TCF4蛋白均显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-455-3p通过抑制β-catenin/TCF4信号通路的转导,抑制人结肠癌细胞增殖、凋亡及糖酵解水平。

microRNA-145在宫颈癌中的表达及其对Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用

目的:探讨microRNA-145在宫颈癌中表达的临床意义及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。方法:收集2002年1月至2004年12月解放军464医院62例宫颈癌患者的组织标本,采用实时荧光定量PCR方法检测microRNA-145表达并将其分为高表达组和低表达组,分析其与临床病理参数的关系。将microRNA-145表达质粒和无义对照质粒分别转染入宫颈癌HeLa中,分为过表达microRNA-145组和对照组,采用细胞免疫荧光染色法分析细胞中β-catenin表达定位的变化,双荧光素酶报告系统检测细胞中TCF/LEF转录活性及与Cateninδ-1的直接作用,采用Western blot法检测microRNA-145对Cateninδ-1、C-MYC和CyclinD1表达的影响。结果:microRNA-145低表达组患者的总生存期为(41.28±2.00)个月,高表达组为(46.06±0.95)个月,两者比较差异具有统计学意义(P<0.05),低表达组患者预后较差。过表达microRNA-145组HeLa细胞中的β-catenin主要分布于胞浆,对照组主要位于细胞核和胞浆;过表达microRNA-145组细胞中TCF/LEF转录活性受到抑制,伴随着Cateninδ-1、C-MYC和CyclinD1表达下调,microRNA-145与Cateninδ-1可直接结合发挥作用。结论:microRNA-145可通过与Cateninδ-1直接作用,抑制Wnt/β-catenin信号通路转导,从而发挥抑制宫颈癌演进的生物学功能。

应用组织芯片检测食管鳞状细胞癌中APC、β-catenin、E-cadherin与cyclin D1的表达及其意义

背景与目的:食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的发生是个多因素多阶段的演进过程。Wnt信号转导通路在肿瘤发生发展中起重要作用。本研究探讨4种Wnt通路上的蛋白在食管鳞癌发生中的作用及在早期诊断中的意义。方法:制作由199例食管鳞癌组织与其癌旁164例正常粘膜、34例基底细胞增生和30例不典型增生上皮组成的组织芯片,应用免疫组化方法检测APC、β-catenin、E-cadherin、cyclin D1的表达情况。结果:APC和E-cadherin在ESCC阳性率分别是69.6%、19.6%,均低于各自正常组(98.0%、96.3%,均为P<0.01),β-catenin和cyclinD1在ESCC的异常表达率分别是65.5%和70.9%,均高于各自正常组(1.2%,0.8%,均为P<0.01)。按正常粘膜→基底细胞增生→不典型增生→ESCC的顺序,APC低表达发生在ESCC,β-catenin和E-cadherin表达异常始于不典型增生,cyclin D1过表达始于基底细胞增生。随着ESCC分化程度由高到低的改变,APC、E-cadherin和cyclin D1阳性率逐渐减少,β-catenin逐渐增加。β-catenin的表达与APC无相关(r=-0.10,P>0.05),与E-cadherin呈负相关(r=-0.31,P<0.01),与cyclin D1呈正相关(r=0.49,P<0.01)。结论:APC、E-cadherin、β-catenin和cyclin D1可能在ESCC发生过程中起重要作用。β-catenin、E-cadherin和cyclin D1的表达检测有助于ESCC的早期诊断。

结直肠癌组织中APC、β-catenin和COX-2的表达及临床意义

目的探讨结肠腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)、β-catenin和COX-2在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征的关系。方法应用组织芯片联合全自动免疫组化EnVision两步法检测APC、β-catenin和COX-2在112例结直肠癌组织和癌旁正常结直肠组织中的表达。结果APC在结直肠癌组织中低表达,与肿瘤分化程度相关(P<0.05);β-catenin和COX-2在结直肠癌组织中高表达,与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期相关(P<0.05);APC的表达与β-catenin、COX-2的表达呈负相关(rs=-0.551,P<0.01;rs=-0.542,P<0.01);β-catenin与COX-2的表达呈正相关(rs=0.558,P<0.01)。结论APC、β-catenin和COX-2三者在结直肠癌的发生、发展中起重要作用,且β-catenin和COX-2的表达影响结直肠癌的侵袭及转移,其机制可能与APC、β-catenin和COX-2蛋白通过Wnt信号通路在结直肠癌中的作用相关。

Wnt信号通路在肿瘤调控方面的研究进展

Wnt信号通路是一条进化上十分保守的信号通路,控制着细胞的生长、分化、凋亡和自我更新。在肿瘤的发生发展中,该通路常常异常激活,并能够和其他信号通路协同或拮抗调节肿瘤的增殖、迁移和侵袭。该文主要对Wnt信号通路的研究进展及其在各类肿瘤生长调控中的作用进行简要综述。

氯化锂诱导毛囊干细胞定向分化中Wnt信号通路介导基因的调控

背景:研究发现氯化锂有促进毛囊干细胞向毛囊上皮定向分化的作用,但其分子调节机制仍不清楚。目的:通过外源性因子氯化锂干预人毛囊干细胞,观察Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因的改变,探讨氯化锂对毛囊干细胞定向分化的诱导作用。方法:取正常成人除皱术后的头皮,采用两步酶消化法结合手术显微镜分选毛囊干细胞,采用角蛋白10抗体-异硫氰酸荧光素鉴定毛囊干细胞。以外源性因子氯化锂干预人毛囊干细胞。结果与结论:氯化锂干预5d后可发现毛囊干细胞体积变大,核浆比减小,Wnt信号通路中β-catenin、cyclinD1表达增强,GSK3β、Tcf3表达减弱,c-myc在氯化锂浓度低时增强浓度高时减弱。提示氯化锂可影响毛囊干细胞中Wnt信号通路β-catenin、GSK3β、Tcf3、c-myc和cyclinD1的表达水平,可能对毛囊干细胞的分化起到重要作用。

紫草素调控Wnt/β-catenin抑制腺瘤性结肠息肉突变结肠癌细胞生长

目的发现腺瘤性结肠息肉(APC)突变结肠癌的小分子抑制剂,为结肠癌靶向治疗提供先导化合物。方法构建稳定表达7*Tcf-GFP/SV40-Cherry(7TGC)双重荧光报告系统的APC突变结肠癌细胞系用于小分子抑制剂筛选。细胞活力测定、克隆形成、EdU和动物移植瘤实验检测小分子对体内外APC突变结肠癌的抑制作用,免疫印记和免疫共沉淀实验探究其分子机制。结果发现了4个抑制APC突变结肠癌细胞Wnt活性的小分子,其中紫草素显著抑制APC突变结肠癌的细胞活力和增殖能力并诱导细胞凋亡;移植瘤实验结果表明紫草素显著减缓体内瘤体生长;免疫印记和免疫共沉淀实验进一步发现紫草素可显著减少β-catenin的水平。结论紫草素可显著抑制APC突变结肠癌的Wnt活性和肿瘤生长。

Wnt通路调控记忆性T细胞的增殖活化

目的探讨Wnt通路在记忆性T细胞(TM)增殖活化中发挥的调控作用。方法建立同种异体(BALB/c-C57BL/6)小鼠皮肤移植模型,采用免疫磁珠方法分选培养C57BL/6小鼠未成熟树突状细胞(imDC)、成熟树突状细胞(mDC)和TM,流式细胞术鉴定。在96孔板或TranswellTM中用imDC和负载BALB/c小鼠抗原的mDC与TM进行混合淋巴细胞反应(MLR)。氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)检测TM的增殖情况。ELISA检测培养上清中白细胞介素2(IL-2)、IL-10、γ干扰素(IFN-γ)的水平。实时定量PCR检测imDC和mDC中Wnt基因的表达情况。双荧光素酶报告基因检测MLR中TM的β联蛋白/T细胞因子(β-catenin/TCF)信号通路转录活性。结果与对照组相比,在96孔板中负载BALB/c小鼠抗原的mDC显著诱导TM的增殖,上调IL-2和IFN-γ,下调IL-10的表达。mDC中Wnt3a和Wnt5a的mRNA表达水平显著高于imDC。mDC与TM共培养可显著增强TM的β-catenin/TCF信号通路转录活性。而在TranswellTM中培养的细胞基本未见细胞增殖。结论负载供者抗原的受者小鼠mDC可通过直接接触的方式有效激活受者效应型TM的增殖,Wnt通路的β-catenin/TCF转录激活可能是介导TM活化增殖的重要信号通路。

TCF4对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株生物学行为的影响

目的探讨T细胞因子4(T cell factor 4,TCF4)小干扰RNA(siRNA)对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株TCF4基因表达的抑制作用及对细胞增殖、迁移、侵袭及周期的影响。方法转染TCF4 siRNA至A431细胞株。应用RT-PCR检测A431细胞TCF4 mRNA的表达,Western blot检测TCF4蛋白的表达,CCK-8方法检测上述各组细胞增殖率(1、2、3、4 d及5 d),小室迁移实验检测细胞迁移情况,Transwell实验检测侵袭情况,流式细胞仪检测细胞周期(24 h)。结果与未转染A43l细胞株和转染空载体的A431细胞株比较,转染TCF4 siRNA表达载体1、2、3、4 d及5 d的细胞增殖率明显降低(P<0.05);TCF4 siRNA表达载体组细胞迁移和侵袭能力明显下降(P<0.05);细胞周期分析发现转染TCF4siRNA使得A431细胞株出现明显的G2/M期阻滞现象。结论采用TCF4特异性siRNA能够抑制皮肤鳞状细胞癌TCF4的表达,从而抑制皮肤鳞状细胞癌的增殖。

人肺癌组织中NLK与TCF4的表达及临床意义

目的:NLK(Nemo-like kinase)是一种MAPK样激酶,与多种肿瘤的发生发展有关。本研究目的是探讨NLK在人肺癌中的表达与TCF4表达的相关性,及其与肺癌临床病理因素的相关性。方法:采用免疫组织化学方法检测NLK和TCF4在120例人肺鳞癌和腺癌组织及癌旁正常肺组织中的表达情况。结果:NLK表达定位于细胞核。NLK在人肺癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织(P<0.01)。NLK在人肺鳞癌组织中的表达显著高于腺癌组织(P=0.016),但与人肺癌组织的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及患者的年龄和性别无明显相关性。TCF4在人肺癌组织中的表达也显著高于癌旁正常肺组织,并与肺癌的高TNM分期相关(P=0.005),但与人肺癌组织的分型、分化程度、淋巴结转移及患者的年龄和性别无明显相关性。NLK在人肺癌组织中的表达与TCF4的表达显著负相关(r=-0.322,P<0.01)。结论:NLK在人肺癌组织中高表达,并定位于细胞核,NLK的高表达与人肺癌的组织学类型相关,并与TCF4的表达负相关。

BATF2对Wnt信号通路影响的研究

Wnt信号通路在各种生物体内高度进化保守,与癌症的发生发展密切相关。BATF2是一个新近发现的基因,研究表明其具有抑癌基因的作用。目前,BATF2与Wnt信号通路的关系尚不清楚,该文用荧光素酶报告基因检测、Real-time PCR和Western blot发现BATF2能影响Wnt信号通路。过表达BATF2可明显下调TCF4/β-catenin的转录活性和Wnt信号通路下游基因的表达,可以下调细胞核中的β-catenin。推测BATF2可能通过下调细胞核中的β-catenin来实现对Wnt信号通路的下调。上述结果为抑制Wnt信号通路用于肿瘤治疗提供了一定的依据。

Wnt5a对成熟树突状细胞诱导初始性T细胞向记忆性T细胞分化的作用

目的:利用负载供者抗原的未成熟或成熟树突状细胞(imDCs或mDCs)体外诱导受者初始性T细胞(TNs)的活化、增殖和分化,并研究Wnt5a基因在这一过程中的可能的作用及其机制。方法:构建高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,转染imDCs。建立同种异体小鼠皮肤移植模型,分选培养受体小鼠的imDCs,mDCs和T_Ns。在96孔板中用负载供者抗原的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/Wnt5a的imDCs、转染腺病毒Ad/CMV/LacZ的imDCs,和正常mDCs与记忆性T细胞(TMs)进行混合淋巴细胞反应。流式细胞术检测T_Ns向T_Ms分化的情况。ELISA检测共培养上清中IL-2,IL-10,IFN-γ细胞因子的浓度。RT-PCR检测T细胞中Wnt/β-catenin通路相关的基因表达情况。双荧光素酶报告基因检测混合淋巴细胞反应中T_Ns的β-catenin/TCF信号通路转录活性。结果:RT-PCR和免疫荧光检测发现mDCs中的Wnt5a的表达水平显著高于imDCs(P<0.05)。与负载供者抗原的mDCs相比,imDCs组可显著诱导T_Ns向T_Ms的分化,上调IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌(P<0.05)。双荧光素酶报告系统检测显示mDCs共培养TNs可显著增强β-catenin/TCF信号通路转录活性(P<0.05)。此外,imDCs通过转染高表达Wnt5a基因的重组腺病毒,也显著提高了其诱导TNs向T_Ms的分化的能力,同时也显著活化了Wnt/β-catenin信号通路(P<0.05)。结论 :在负载供者抗原的DCs与受者T_Ns混合淋巴细胞反应过程中,可诱导T_Ms分化形成,其中DCs的Wnt5a基因介导的T_Ns内β-catenin/TCF信号通路转录激活可能是其中一条重要的途径。