SurvivinshRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长情况的影响

目的在转录后水平进行干预的RNA干扰技术在多基因治疗中的应用越来越广泛。文中旨在构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过联合RNAi和外源性补充的方式研究Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体对结肠癌裸鼠移植瘤生长情况的影响。方法选取35只裸鼠随机数字表法分为5组,即Survivin shRNA-APC双基因组、Survivin shRNA组、APC组、空载组和空白组,每组7只;将已经构建好的处于对数生长期的双基因共表达Survivin shRNA-APC、Survivin shRNA及APC稳转株,空载稳转株,HT-29结肠癌细胞(均为2×106/mL)分别注射至5组裸鼠左前腋下成瘤,构建人HT-29结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型;通过测量瘤体体积、重量,检测移植瘤生长抑制率,Real time PCR检测移植瘤组织survivin mRNA的表达,免疫组化检测Survivin蛋白的表达,TUNEL检测凋亡情况。结果与空白组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组移植瘤平均体积、平均重量均减少(P<0.05);与空载组比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组平均体积、平均移植瘤重量亦减少(P<0.05),而体积抑制率、瘤重抑制率均增加(P<0.05);与双基因组比较,APC组、Survivin shRNA组移植瘤平均体积、平均重量均增加(P<0.05)。与空白组和空载组相比,APC组、Survivin shRNA组、Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量明显降低(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,双基因组移植瘤组织Survivin mRNA和蛋白表达相对含量亦明显降低(P<0.05)。与空白组裸鼠移植瘤组织结肠癌细胞凋亡指数[(9.89±0.31)%]比较,APC组、Survivin shRNA组、双基因组[(31.19±1.79)%、(33.64±2.03)%、(56.72±3.17)%]明显升高(P<0.05),而APC组、Survivin shRNA组、双基因组亦较空载组[(10.06±0.43)%]明显升高(P<0.05);与Survivin shRNA组、APC组相比,Survivin shRNA-APC双基因组移植瘤组织癌细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。结论 Survivin shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体能够使Survivin基因的表达水平降低,促进结肠癌细胞的凋亡,抑制移植瘤的生长,且优于单个基因的影响。

慢病毒介导Survivin shRNA与结肠腺瘤息肉易感基因片段联合对HT-29细胞的影响

目的:观察Survivin sh RNA、结肠腺瘤息肉易感基因(adenomatous polyposis coli,APC)片段联合对HT-29细胞Survivin表达及细胞增殖的影响.方法:构建Survivin sh RNA慢病毒载体、A P C有效片段慢病毒载体,对H T-29细胞分别采用单慢病毒载体侵染及联合侵染.实验分阴性对照组、空载组、sh RNA组、APC组、sh RNA+APC联合组,对侵染48 h后的HT-29细胞进行real-time PCR、Western blot及CCK8细胞增殖检测,检测Survivin m RNA、蛋白表达水平及对细胞增殖的影响.结果:(1)sh RNA+APC联合组与其余各组相比,Survivin m RNA表达量显著下降(P<0.05);(2)s h R N A+A P C联合组与其余各组相比,其Survivin蛋白抑制率明显高于其余各组(P<0.05);(3)sh RNA+APC联合组与其余各组相比,细胞增殖速度低于其余各组(P<0.05).结论:Survivin sh RNA与APC片段联合能抑制HT-29细胞内Survivin m RNA及蛋白的表达,同时能够抑制细胞增殖能力,并且优于单个基因侵染.

人端粒酶逆转录酶基因小片段干扰RNA慢病毒表达载体的构建及其在子宫颈癌caski细胞的表达

目的构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)慢病毒(lentivirus,LV)表达载体,并观察其在子宫颈癌caski细胞的表达情况。方法以Designer3.0(Genepharma)软件设计靶向h TERT基因特异性的小片段RNA(sh RNA)干扰序列,将h TERT-sh RNA基因片段插入重组慢病毒p GLV3/H1/GFP+Puro,构建慢病毒表达质粒LV3-sh RNA-h TERT,酶切、DNA测序验证h TERT片段准确性。LV3-sh RNA-h TERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞。将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-sh NC的caski细胞)和h TERT干扰组(感染携带LV3-shh TERT慢病毒的caski细胞)。绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测转染后基因h TERT m RNA的表达情况,CCK-8法检测caski细胞增殖情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功;成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞。荧光定量PCR检测结果证实构建的h TERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体可显著抑制h TERT基因的表达。h TERT干扰组细胞增殖受抑制,生长速度较阴性对照组生长缓慢。结论成功构建了携带h TERT-sh RNA慢病毒表达载体LV3-sh RNA-h TERT,并稳定转染子宫颈癌caski细胞。该载体能够有效抑制h TERT的表达,使子宫颈癌caski细胞增殖缓慢,为进一步探讨h TERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础。

Survivin shRNA和APC片段双基因的载体构建及其在HT-29细胞的表达

目的研究表明APC、Survivin 2种基因表达异常在结肠癌的发生发展中具有重要意义。构建Survivin shRNA、APC功能片段双基因共表达慢病毒载体并观察其能否于HT-29结肠癌细胞中成功表达,同时观察其是否能够对结肠癌细胞凋亡产生影响。方法构建3对互补Survivin shRNA片段,从其中筛选出一条最佳干扰shRNA片段,与APC功能片段(aa1020-1698)相连接构建双基因共表达质粒载体。将HT-29细胞分为实验组、空载组、空白组3组,慢病毒对HT-29进行侵染,观察是否有绿色荧光表达及对转染细胞进行realtime PCR、Western blot检测Survivin、APC基因表达水平。通过检测Caspase-3活性来检测细胞凋亡情况。结果 1Real time PCR检测后显示对Survivin基因起到最佳干扰效果的片段为shRNA3序列。2构建出的shRNA载体经过送序验证比对后,3对shRNA序列与最初设计的序列完全相同。在HT-29细胞中可见绿色荧光,实验组Survivin相对含量(31.71±1.49)较空载组(100±0)、空白组(95.12±2.15)明显减少(P<0.05),APC mRNA表达水平较空载组(0±0)、空白组(0.51±0.15)明显增加(P<0.05)。实验组Survivin蛋白相对含量(0.18±0.01)较空白组(0.24±0.04)、空载组(0.22±0.03)明显减少,APC蛋白表达水平(0.147±0.016)较空白组(0.095±0.012)、空载组(0.108±0.015)明显升高(P<0.05)。3实验组凋亡相对比值(0.573±0.050)较空白组(0.390±0.040)、空载组(0.407±0.030)明显增加(P<0.05)。结论成功构建Survivin-shRNA-APC双基因共表达慢病毒载体,并能够在HT-29结肠癌细胞中成功表达,该双基因共表达载体可为后续利用该载体进行基因治疗的基础实验提供材料。

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P>0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。

mFVII／Fc融合基因慢病毒载体的构建及在hBMSCs中表达的研究

目的构建人凝血因子VII（FVII）与免疫球蛋白Fc片段融合基因（mFVII／Fc）的慢病毒表达载体，并检测其在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）中的表达情况，获取mFvII／Fc稳定表达的干细胞载体。方法体外克隆人凝血因子VII，用点突变技术在基因水平将341部位Lys突变为Ala后，利用DNA连接酶与免疫球蛋白IgG1 Fc片段的基因融合，经酶切整合，测序鉴定后转染人胚肾293T细胞包装为重组mFVII／Fc慢病毒载体，鉴定载体构建成功后，测定慢病毒滴度。确定转染第三代hBMSCs的最佳MOI值后批量转染，荧光显微镜下观察GFP的表达情况，RT—PCR、ELISA分别在不同时间点对mFVII／Fc的mRNA及蛋白表达进行相对定量分析。结果所构建融合基因与GenBankID：AF272774对比，除同义变异外完全相符；包装的慢病毒滴度为2×10^8TU／ml；hBMSCs鉴定结果为CD＋（98．08％）、CD＋（97．63％）、CD；（0．31％）、CD＋（0．58％）；转染hBMSCs72h后的效率为（84±3）％，经RT—PCR及ELISA证实转染mFVII／Fc基因的hBMSCs有大量mRNA转录和蛋白表达水平。结论实验成功获得了融合基因的hBMSCs稳定遗传表达载体，为靶向前列腺癌组织因子研究及肿瘤基因治疗研究提供了实验依据。