红景天苷调控APC-Cdh1对永生化神经前体细胞增殖分化的影响

目的探讨红景天苷通过调控APC-Cdh1对永生化神经前体细胞(INPC)增殖分化的影响及机制。方法取对数生长期的INPC用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代,处理组加入100μg/mL的红景天苷,对照组无任何处理,培养48 h后,采用流式细胞仪检测细胞周期的分布变化,采用MTT比色法检测INPC细胞增殖情况。加入红景天苷诱导INPC分化,利用免疫荧光检测MAP2的表达及细胞计数观察INPC向神经元分化比例,实时定量RT-PCR检测后期促进复合物(APC)的调控因子(Cdh1)及其下游分化抑制因子2(Id2)mRNA的表达。结果与对照组相比,INPC经过100μg/mL红景天苷处理48 h后,G_(1)~G_(0)期细胞增多(P<0.05),S期减少(P<0.05);MTT显示细胞增殖活力降低(P<0.05);免疫荧光显示MAP2阳性神经元的比例增高(P<0.05);Cdh1 mRNA的表达增加(P<0.05),而Id2 mRNA表达降低(P<0.05)。结论红景天苷100μg/mL能抑制INPC的增殖,促进其向神经元分化,其作用机制可能是通过上调后期促进复合物的调控因子Cdh1、下调分化抑制因子Id2的表达来实现的。

氧糖剥夺对体外培养大鼠星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制

目的探讨氧糖剥夺对星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及其机制。方法①体外纯化培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,随机分为对照组、氧糖剥夺1h复氧组、氧糖剥夺6h复氧组,Western blot检测Cdh1及Skp2蛋白的表达变化;②将体外纯化培养的星形胶质细胞随机分为对照组、氧糖剥夺6h组、单纯缺氧6h组,Western blot检测Cdh1蛋白的表达变化,血糖仪检测培养液中葡萄糖含量的变化。结果①与对照组相比,氧糖剥夺1h复氧组、氧糖剥夺6h复氧组Cdh1蛋白表达均下降,Skp2蛋白表达均增加(P<0.05),氧糖剥夺1h复氧组与氧糖剥夺6h复氧组组间Cdh1、Skp2蛋白表达差异无统计学意义;②与对照组相比,氧糖剥夺6h组Cdh1蛋白表达明显下降,单纯缺氧6h组没有明显变化,氧糖剥夺6h组与单纯缺氧6h组组间差异有统计学意义(P<0.05);③单纯缺氧6h组细胞外液葡萄糖摄取率低于对照组(即常氧组)[(21.43±6.74)%vs.(26.98±9.21)%,P<0.05]。结论氧糖剥夺后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达减少,其变化与细胞外液中缺少葡萄糖有关。

慢病毒过表达Cdh1蛋白对星形胶质细胞反应性增殖作用的初步研究

目的探讨慢病毒过表达Cdh1蛋白对星形胶质细胞反应性增殖的影响。方法体外纯化培养大鼠星形胶质细胞:(1)随机分为Cdh1慢病毒组及空病毒组,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测Cdh1及Skp2蛋白表达的变化;(2)随机分为单纯氧糖剥夺/复氧组、Cdh1慢病毒干预组、空病毒干预组,氧糖剥夺1h复氧48h后,CCK-8法检测细胞增殖的变化。结果与空病毒组相比,Cdh1慢病毒组Cdh1蛋白表达总量增加,Skp2蛋白表达下降(P<0.05);与单纯氧糖剥夺/复氧组相比,Cdh1慢病毒干预组细胞反应性增殖受到抑制(P<0.05),空病毒组没有变化(P>0.05)。结论慢病毒过表达Cdh1蛋白对氧糖剥夺再复氧后星形胶质细胞的反应性增殖有一定的抑制作用。

CDH1、FANCB和APC基因多态性与中国人群肺癌易感性的关系

背景与目的肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是导致肺癌发生的重要因素之一,但其机制仍未阐明。本研究拟探讨CDH1、FANCB、APC基因SNP与肺癌遗传易感性的关系。方法采用病例对照研究方法,收集来自天津医科大学总医院肺部肿瘤外科270例肺癌病例,同时收集445名健康志愿者的血液样本作为对照,并提取基因组DNA,使用Taqman~?SNP基因分型试剂盒进行基因分型,分析CDH1基因rs201141645、FANCB基因rs754552650和APC基因rs149353082三个SNPs位点在中国人群中的分布。采用卡方检验和Logistic回归分析探索不同基因型与肺癌发病风险之间的关系。结果FANCB基因rs754552650位点的AA、A/G和GG基因型的分布频率在对照组中分别为27.2%、52.6%和20.2%。AA和A/G基因型分布频率在病例组中分别为93.7%、6.3%,未检测到GG基因型。FANCB基因的rs754552650位点的A/G基因型在病例组和对照组中存在显著差异。携带者患肺癌的风险明显降低(OR=0.035,95%CI:0.020-0.062,P<0.001)。CDH1基因rs201141645 A/C和CC基因型仅存在于对照组中。此外,在病例组中仅发现1个样本存在APC基因rs149353082 C/G基因型。结论在中国人群中,FANCB基因rs754552650 A/G基因型携带者患肺癌的风险明显降低。

肼苯哒嗪对宫颈癌细胞系侵袭力的影响

目的探讨肼苯哒嗪去甲基化作用对人宫颈癌细胞系HeLa(HPV18型)、CaSki和SiHa(HPV16型)细胞侵袭力的抑制影响。方法 Transwell侵袭小室法检测肼苯哒嗪处理前后人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力。甲基化特异性PCR(MSP)法检测肼苯哒嗪处理前后各细胞系中APC基因和CDH1基因5′端启动子区CpG岛甲基化状态。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测肼苯哒嗪处理前后,上述三种细胞系中APC和CDH1mRNA表达情况。结果与未处理组比较,10μmol/L肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力抑制作用差异无统计学意义,20μmol/L与40μmol/L肼苯哒嗪对人宫颈癌细胞系HeLa、CaSki和SiHa的侵袭力抑制作用差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);且不同浓度之间有差异,以40μmol/L肼苯哒嗪抑制作用最强。40μmol/L肼苯哒嗪处理后,上述三种细胞系中APC和CDH1基因呈现不同程度的去甲基化现象。经40μmol/L肼苯哒嗪处理后,上述三种细胞系中APCmRNA表达分别是处理前的5.89倍、8.46倍及0.97倍,CHD1mRNA表达分别是处理前的4.82倍、5.90倍及8.46倍。结论一定浓度的肼苯哒嗪能明显抑制宫颈癌细胞系HeLa、CasKi和SiHa的侵袭力,其作用机制之一是通过去甲基化作用影响APC和CHD1的表达。

表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达大鼠Cdh1基因的重组慢病毒载体。方法根据大鼠Cdh1基因的核苷酸序列，合成目的基因片段并亚克隆到慢病毒表达载体pGC-FU的AgeI酶切位点间，命名为pGC-FU-Cdh1。对pGC-FU-Cdh1进行PCR扩增及测序鉴定。将293T细胞按完全随机法分为实验组（每组3只）及对照组（每组3只），分别将pGC-FU-Cdh1及空质粒pGC-FU以脂质体法转染至293T细胞，倒置荧光显微镜观察后，Western blot法检测Cdh1-GFP的表达情况，慢病毒载体LV-Cdh1的包装浓缩及滴度测定。结果重组慢病毒表达载体pGC-FU-Cdh1经PCR扩增鉴定及测序鉴定均显示有特异性基因片断，证明大鼠Cdh1基因正向插入慢病毒表达载体pGC-FU中；转染293T细胞后，Westernblot法检测到实验组有外源性融合蛋白Cdh1-GFP的表达（每组3只），对照组无Cdh1-GFP的表达（n=0）（P=0．014）；慢病毒载体LV-Cdh1包装浓缩后，Reahime PCR法测定滴度为2E＋8TU／ml。结论成功构建表达大鼠Cdh1基因的重组质粒pGC-FU-Cdh1，并包装为慢病毒，为进一步研究Cdh1功能及基因治疗奠定了基础。