APE/Ref-1蛋白与脑缺血/再灌注神经元损伤

Cerebral ischemia and the aftermath of reperfusion form a hypoxic/hyperoxic sequence of events that can trigger DNA damage in neurons of central nervous system. Neuronal apoptosis will happen without immediate DNA repair. APE/Ref-1 is a multifunctional protein involoved in DNA base excision repair pathway and in redox reguiation of DNA-binding activity of AP-1 family members, which may play an important role in protection of postischemic neuronal damage.

吉西他滨对人肺癌A549细胞株CN-Ⅱ，APE／Ref-1mRNA和蛋白表达的影响

【目的】研究人肺癌A549细胞株在吉西他滨化疗时CN-Ⅱ,APE/Ref-1基因表达的变化,并探讨其在肺癌化疗耐药中所起的作用。【方法】不同浓度吉西他滨0、10、20、40及60μmol/L作用人肺癌A549细胞株24h,分别以RT-PCR及Western blot方法测定用药后CN-Ⅱ和APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达情况。【结果】吉西他滨作用人肺癌A549细胞株24h后,CN-Ⅱ和APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达水平均明显上升,并与吉西他滨的浓度呈正相关(CN-ⅡRT-PCR:r=0.687,P=0.009;Western blot:r=0.594,P=0.021;APE/Ref-1RT-PCR:r=0.669,P=0.010;Western blot:r=0.562,P=0.029)。【结论】CN-Ⅱ和APE/Ref-1在肺癌化疗时表达明显增强,可能与化疗耐药性的产生有关,并提示针对CN-Ⅱ和APE/Ref-1的靶向干预可能有助于提高肺癌的化疗敏感性。

过氧化氢对PC12细胞中硫氧还蛋白和APE/Ref-1基因表达的影响

目的观察过氧化氢(H2O2)对硫氧还蛋白和APE/Ref-1基因表达的影响,探讨H2O2预处理对神经细胞具有适应性保护的分子机制。方法以PC12细胞作为神经细胞模型,以200和400μmol/L浓度的H2O2处理PC12细胞,用MTT法检测细胞的损伤程度,以Western blot方法测定硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达水平。结果200μmol/LH2O2促进PC12细胞的硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达,400μmol/LH2O2也促进PC12细胞的APE/Ref-1表达,但使PC12细胞的硫氧还蛋白表达显著降低。结论促进硫氧还蛋白和APE/Ref-1表达可能是低浓度H2O2预处理对神经细胞具有适应性保护的分子机制。

姜黄素对缺血/再灌注大鼠APE/Ref-1表达及细胞凋亡的影响

目的观察姜黄素对大鼠全脑缺血/再灌注损伤后海马神经元凋亡与DNA修复蛋白APE/Ref-1表达的影响,探讨其对脑缺血损伤后的保护作用。方法将144只雄性SD大鼠随机平均分为假手术组(SO组)、缺血/再灌注组(IR组)和姜黄素干预组(CU组)各48只。建立大鼠全脑缺血/再灌注模型,CU组于再灌注后即刻经腹腔注射姜黄素。分别于再灌注后2、6、12、24、48、72 h处死大鼠,提取大鼠脑组织。原位末端标记法检测海马CA1区的细胞凋亡情况;免疫组化SABC法检测APE/Ref-1的表达。结果 SO组神经元细胞凋亡较少,IR组凋亡的神经元细胞于再灌注6 h开始增多,48 h细胞凋亡率达到最高。与SO组比较,IR组细胞凋亡率增高(P<0.01)。CU组在再灌注6 h后的各时点神经元细胞凋亡较IR组少(P均<0.01)。SO组APE/Ref-1阳性细胞在各时点较多;IR组于再灌注后2 h APE/Ref-1阳性细胞开始出现明显减少,一直持续至72 h,与SO组比较有统计学差异(P均<0.01);CU组APE/Ref-1阳性细胞率各时点与IR组比较均有统计学差异(P均<0.01)。结论姜黄素发挥脑保护作用的机制可能与减缓DNA修复蛋白APE/Ref-1表达的下降和阻止脑缺血/再灌注损伤区神经元细胞的凋亡有关。

PC12细胞APE/ref-1cDNA的克隆和表达

APE Ref 1是双功能核蛋白 ,它既能在碱基切除修复过程中切除脱嘌呤 脱嘌啶位点 ,又能促进包括AP 1、Myb和NF κB等受氧化还原调节的转录因子对DNA的结合 .从PC12细胞中抽提总RNA ,经逆转录PCR(RT PCR)扩增出APE ref 1cDNA并克隆到pQE3 1表达质粒上的BamHⅠ和PstⅠ位点间 .经测序表明 ,PC12细胞的APE ref 1cDNA以正确的阅读框架重组进入表达质粒 ,表达重组质粒pQE3 1 APE在宿主菌BL2 1中得到稳定表达 .SDS PAGE鉴定表明 ,带 6个组氨酸的融合蛋白分子量为 3 8kD ,并经Ni NTA琼脂糖亲和纯化得到电泳纯融合蛋白 .Western印迹证明重组蛋白为APE ref 1融合蛋白 .

APE1/Ref-1线粒体定位机制的研究

APE1/Ref-1是一种重要的多功能蛋白,主要功能是DNA修复和转录因子的氧化还原调控。目前认为,核编码基因的线粒体主动转运主要依靠线粒体外膜和内膜上一系列转运酶复合体,称为外膜转运酶（translocase of outer membrane,TOM）和内膜转运酶（translocase of inner membrane,TIM）。基本过．程为线粒体外膜TOM复合体中的受体亚基，包括TOM20、TOM22和TOM70识别前体蛋白上的线粒体定位信号，而后通过TOM40等亚基形成的共同转运通道（general import pore，G1P）进入线粒体。

肾细胞癌中Ref-1/APE的表达特点及其意义

目的探讨Ref-1/APE蛋白表达与肾细胞癌生物学行为的关系。方法应用免疫组织化学方法检测58例肾细胞癌和11例正常肾组织中Ref-1/APE的表达。结果所有肾细胞癌和正常肾组织均有Ref-1/APE的表达,但在细胞内的表达定位有所不同,肾细胞癌阳性颗粒表达部位以细胞核为主,并且Ref-1/APE的表达定位与肿瘤分级、分期密切相关,差异有显著性(P<0.01);11例正常肾组织中仅见肾小管上皮细胞表达。结论Ref-1/APE基因可能与肾细胞癌的发生、发展有关。检测Ref-1/APE的表达及移位于细胞质的情况可能为肾细胞癌的恶性程度判定、预后评估及进一步治疗提供依据。

APE1/Ref-1与肿瘤的研究进展

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1又称氧化还原因子-1,是一种双功能酶,不仅具有核酸内切酶活性,发挥DNA修复功能,而且具有氧化还原功能,调控多种重要转录因子的活性。目前研究发现APE1/Ref-1在人体多种肿瘤中表达且与肿瘤的发生、发展及预后相关。APE1/Ref-1可能成为极具潜力的肿瘤基因治疗的新靶点。本文就APE1/Ref-1的结构、功能及在肿瘤研究方面的进展作了一系列的回顾与总结。

大鼠耳蜗缺血再灌注后APE/Ref-1表达研究

目的观察APE/Ref-1在正常成年SD大鼠内耳蜗缺血再灌注后的表达变化。方法成年SD大鼠24只,随机分成2组(n=12),分别为假手术对照组、缺血再灌注组。各组动物于再灌注24h取出左侧耳蜗,每组随机4个耳蜗,石蜡包埋切片,行免疫组织化学观察APE/Ref-1表达分布。各组余下耳蜗组织进行均浆,进行免疫印记实验,测定匀浆中APE/Ref-1蛋白表达。结果与假手术对照组相比,缺血再灌注组APE/Ref-1蛋白表达显著增加(P<0.05)。在假手术组大鼠耳蜗中,APE/Ref-1主要表达在正常螺旋神经节区,细胞内定位在细胞浆和细胞核,螺旋韧带和血管纹也可以见到表达。缺血再灌注组APE/Ref-1在耳蜗这些部位的表达显著增加。结论正常大鼠内耳表达APE/Ref-1,主要表达在螺旋神经节区。耳蜗缺血再灌注后,APE/Ref-1在内耳的表达显著增加,提示APE/Ref-1可能与耳蜗缺血再灌注氧化损伤密切相关。

人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株APE1/Ref-1表达升高

背景:吉西他滨是中晚期胰腺癌的主要化疗药物,但由于胰腺癌对吉西他滨存在高度先天性和获得性耐药,吉西他滨不能明显改善胰腺癌患者的预后。目的:探讨DNA损伤修复及其碱基切除修复途径中的关键酶人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1/氧化还原因子-1(APE1/Ref-1)表达与胰腺癌吉西他滨耐药之间的关系。方法:应用前期研究建立的人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990-0.5(耐药指数9.32)及其亲本细胞株SW1990,以彗星实验评估两者经吉西他滨作用后的DNA损伤程度,real-time PCR和蛋白质印迹法检测APE1/Ref-1 mRNA和蛋白表达。结果:经吉西他滨作用24 h,SW1990-0.5和SW1990细胞的彗星实验OTM值分别为0.32±0.13和26.96±6.83,相对于SW1990细胞,SW1990-0.5细胞的APE1/Ref-1 mRNA表达量为2.48±0.49,两者APE1/Ref-1蛋白相对表达量分别为1.57±0.08和0.84±0.06,组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:DNA损伤修复可能与胰腺癌吉西他滨耐药相关,APE1/Ref-1表达上调可能是通过修复DNA损伤参与胰腺癌对吉西他滨耐药。

双功能基因APE1/Ref-1：肿瘤治疗的新靶点

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子（apurinic／aprimidinic endonuclease／redox factor-1，APE1／Ref-1）是一个生物大分子功能复合体的范例，它不仅是DNA碱基切除修复（base excision repair，BER）途径的主要限速酶，而且是一种重要的氧化还原因子，通过调控多种转录因子氧化还原状态而改变其转录活性。APE1／Ref-1参与多种重要的细胞生物学过程，是DNA损伤修复、氧化应激和转录因子调控基因表达的重要枢纽分子，对细胞凋亡、增殖和分化有重要的影响。

Ref-1蛋白在细胞中表达、分布的改变与肿瘤的关系

越来越多的研究表明，在正常真核生物细胞中，DNA存在着不断的损伤、修复和重组。而内环境的稳定有赖于DNA的损伤和多种DNA损伤修复途径的平衡。在正常细胞，DNA损伤得到正确的修复。但是，在肿瘤细胞这种平衡被打破。APE／Ref-1是一种广泛存在各个组织的多功能蛋白酶，它既是细胞DNA氧化损伤和烷化剂损伤的重要修复因子，又是多种转录因子DNA结合活性的重要调控因子。考察APE／Ref-1在肿瘤中的表达及分布改变，对于了解肿瘤的发生、发展机制，以及癌症的早期诊断、判断预后均有十分重要的意义。本文就APE／Ref-1与肿瘤的关系作综述。

黄芪苷Ⅳ防治大鼠脑皮层缺血-再灌注损伤的作用和对APE／Ref-1表达的研究

目的：研究黄芪苷Ⅳ（Astragaloside Ⅳ，AST）对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用及探索AST治疗脑缺血-再灌注损伤的可能药物作用靶点。 方法：实验大鼠被随机分为4个实验组：缺血-再灌注模型组（M组），低剂量治疗组（AST1），高剂量治疗组（AST2），假手术组（Sham）。AST1和AST2组大鼠在缺血前30min腹腔注射AST 1mg／kg、4mg／kg。所有接受手术的鼠均采用线栓法制备局灶性大脑中动脉阻塞模型（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）。再灌注后6h处死大鼠前进行神经行为评分，应用TYC染色法检测脑梗塞范围，HE染色观察病理变化；

亚低温对大鼠短暂性脑缺血后APE/Ref-1表达、神经元凋亡的影响

目的 (1 )探讨短暂性脑缺血后无嘌呤 /无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 - 1 (APE/ Ref- 1 )在海马 CA1区的变化过程。 (2 )探讨短暂性脑缺血后海马 CA1区发生的神经元凋亡情况。 (3)探讨 APE/ Ref- 1在海马 CA1区的变化及其与该区神经元凋亡的内在联系。 (4 )探讨采取亚低温干预措施后APE/ Ref- 1与神经元凋亡在短暂性脑缺血后海马 CA1区的变化。 (5 )探讨亚低温干预后 APE/ Ref- 1的变化在亚低温脑保护中的作用。 方法 采用大鼠短暂性脑缺血模型及亚低温方法 ,通过神经元尼氏体染色、TU NEL 染色、APE/ Ref- 1蛋白免疫组织化学染色、APE/ Ref- 1蛋白免疫组织化学与TU NEL双重染色等方法 ,观察短暂性脑缺血后海马 CA1区神经元存活、凋亡、APE/ Ref- 1蛋白表达情况及亚低温的影响。 结果 (1 )与假手术组相比 ,常温缺血组脑海马CA1区神经元缺失远较亚低温缺血组多 (P<0 .0 1 )。 (2 )常温缺血组及亚低温缺血组脑海马 CA1区均存在神经元凋亡。亚低温缺血组神经元凋亡出现的时间比常温缺血组迟 ,且凋亡数较常温组少 (P<0 .0 1 )。 (3)假手术组海马 CA1区神经元广泛表达 APE/ Ref- 1蛋白 ,常温缺血组及亚低温缺血组缺血后 APE/ Ref- 1蛋白表达均有下降 ,亚低温缺血组APE/ Ref- 1蛋白表达下降程度较常?

APE1/Ref-1在肿瘤治疗中的应用前景

脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1／氧化还原因子-1（apurinic／apyrimidinic endonuclease／redox factor-1，APE1／Ref-1）是生物体中一种重要酶类，是一个多功能蛋白。APE1在DNA碱基切除修复途径（BER）中作为人类中最主要的AP（脱嘌呤脱嘌啶）内切酶，占到AP内切酶活性总体的95％，是保护细胞免除多种DNA损伤药物毒性作用的必须酶。

APE1和p53蛋白在A549细胞和HeLa细胞中的结合作用

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinic endonuclease,APE1)和p53蛋白内源性和外源性相互结合作用。方法将重组质粒pET42a-hAPE1转染E.coli BL21(DE3),应用IPTG诱导GST-APE1蛋白表达,鉴定后经金属螯合层析技术纯化,通过Western blot鉴定纯化蛋白,得到GST-APE1融合蛋白。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和GST蛋白沉降实验分别检测内源性和外源性APE1和p53蛋白结合作用,免疫荧光标记结合激光共聚焦显微镜技术确定APE1和p53蛋白亚细胞定位。结果转染质粒经IPTG诱导表达,应用SDS-PAGE发现GST-APE1在预期位置64×103处存在阳性条带,"Ni"柱纯化后得到GST-APE1融合蛋白,通过Western blot鉴定。免疫共沉淀和GST蛋白沉降实验证实APE1和p53存在内源性和外源性结合作用。激光共聚焦显微镜观察免疫荧光标记的APE1和p53蛋白均为核浆共表达蛋白,氧化应激处理后,蛋白逐渐由胞浆向胞核移位,二者共定位于核膜处较明显。结论 APE1和p53蛋白在A549和HeLa细胞中存在内源性和外源性结合作用,可能与其转录调控及肿瘤放化疗疗效有关。

APE1/Ref-1表达在小鼠放射性肺损伤形成中的变化特点

目的观察小鼠放射性肺损伤过程中DNA损伤修复关键酶脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子(apurinic/aprimidinic endonuclease/redox factor-1,APE1/Ref-1)表达的动态变化,初步探讨APE1/Ref-1在放射性肺损伤发生、发展中的作用。方法雌性昆明小鼠30只,随机分为照射组18只和对照组12只。照射组用8MV直线加速器给予小鼠全胸20Gy单次照射,对照组佯装照射。在照射后1、3、7、14、28、56d共6个时相点,分批活杀小鼠(照射组3只,对照组2只),观察其全肺大体形态改变,取右肺组织,光镜下观察组织形态学变化,免疫组化SP法检测APE1/Ref-1;取左肺组织,Western blot方法检测APE1/Ref-1蛋白表达。结果正常小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1呈胞核表达为主,而在小鼠放射性肺损伤不同阶段肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1表达特征有所改变,呈核浆共同表达和胞浆表达为主;并且APE1/Ref-1表达呈现先增高后降低的趋势,照射后1d开始升高,3d达高峰,且明显高于对照组,此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低,28d降至对照组水平,56d明显低于对照组。结论电离辐射可以刺激APE1/Ref-1蛋白的表达并使其表达发生由核内转向浆内和先增高后降低的特征改变,表明APE1/Ref-1可能在放射性肺损伤修复过程中起着重要作用。

人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1^+APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用。方法采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1^+上,构成pcDNA3.1^+APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平。结果经酶切及测序证实APE1/ Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1^+APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1^+APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加。结论成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础。