APE-1 shRNA与过表达载体的构建及其对肝细胞免疫炎性因子、细胞凋亡的影响

目的探究脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1,APE-1)小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)与过表达载体构建及对肝细胞免疫炎性因子表达、细胞凋亡的影响。方法基于基因表达数据库GEO获取肝移植免疫耐受患者及非耐受患者外周血基因表达谱数据,通过R语言程序分析差异表达基因,获得肝移植免疫耐受相关基因APE-1。构建4个平行APE-1 shRNA载体(APE-1 shRNA_1,APE-1 shRNA_2,APE-1 shRNA_3,APE-1 shRNA_4),经质粒测序、Real-time PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白表达筛选沉默效果最优的APE-1 shRNA。同理构建并鉴定APE-1过表达载体。STRING网站预测APE-1蛋白互作网络。利用构建的APE-1 shRNA和过表达载体,干预人正常肝细胞L-02的APE-1表达(分为对照组、APE-1沉默组和APE-1过表达组),ELISA法检测各组细胞炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡变化。结果筛选获得35个肝移植免疫耐受相关显著差异表达基因,选取肝移植免疫耐受患者高表达基因APE-1。获得沉默效果最优APE-1 shRNA_1载体及APE-1过表达载体。预测APE-1与ANP32A、FEN1、HMGB2、LIG1、MUTYH、NTHL1、OGG1、PCNA、POLB、SET等蛋白具有潜在相互作用。APE-1沉默导致L-02细胞(APE-1沉默组)炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ表达显著升高,细胞凋亡率显著增加;相反,APE-1过表达后(APE-1过表达组)L-02细胞炎性因子表达显著降低,细胞凋亡率显著降低。结论 APE-1表达可影响人正常肝细胞株L-02细胞炎性因子表达及细胞凋亡,这可能是肝移植免疫耐受中的关键基因。

APE-1对肝癌细胞裸鼠成瘤能力及PKM2表达的影响及机制探索

目的探索脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶-1(APE-1)对肝癌细胞裸鼠成瘤能力及丙酮酸激酶M2(PKM2)表达的影响及机制。方法基于沉默APE-1表达的肝癌Hep3B稳定细胞株,进行BALB/c-Nude裸鼠皮下成瘤。APE-1沉默组接种APE-1沉默表达的细胞,对照组接种转染空白质粒的细胞,每组10只裸鼠。8周后处死裸鼠,计算成瘤率,完整剥离肿瘤组织,称瘤体重量并计算肿瘤体积。免疫组化及Westernblot法检测肿瘤组织中APE-1及细胞增殖标志性蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、核KI-67抗原(Ki-67)表达。同样方法检测PKM2蛋白表达后,基于TCGA数据库中374例肝癌患者数据,分析APE-1与PKM2表达相关性,并比较PKM2不同表达肝癌患者中生存曲线差异。结果2组裸鼠成瘤率均为100%,APE-1沉默组的肿瘤重量及体积均小于对照组(P<0.05)。APE-1沉默组肿瘤组织中APE-1、PC-NA、Ki-67和PKM2蛋白表达均低于对照组(P<0.05)。APE-1和PKM2表达线性正相关(P<0.001),且PKM2在肝癌患者中高表达组和低表达组整体生存曲线分布比较差异有统计学意义(P<0.001),低表达组生存期更长。结论APE-1可能通过影响PKM2抑制肝癌细胞裸鼠成瘤能力,具有较强的抗肿瘤潜能。

沉默APE-1对肝癌细胞Hep 3B转录组表达谱及TNF信号通路的影响

目的探索沉默APE-1对肝癌细胞Hep 3B转录组表达谱及TNF信号通路的影响。方法基于沉默APE-1表达的肝癌Hep 3B稳定细胞株,进行转录组测序。实验组为APE-1沉默表达的细胞,对照组为转染空白质粒的细胞(n=3)。生物信息学分析肝癌细胞差异表达基因变化及差异基因的GO、KEGG、DO功能富集,蛋白互作网络。针对TNF信号通路关键基因TNFAIP3、MAP2K6,RT-PCR检测其在实验/对照组细胞中表达,收集10对肝癌/癌旁临床样本,免疫组化检测其蛋白表达。基于TCGA数据库中374例肝癌患者数据,分析APE-1和TNFAIP3,APE-1和MAP2K6表达相关性。结果沉默APE-1导致肝癌细胞Hep 3B中84个基因上调,39个基因下调。差异变化前10位的基因为APE-1、CEMIP、MAP2K6、TAF11L11、CNGB1、COL5A3、OTULINL、DNAJC12、FOLR1、ACKR3。RT-PCR验证TNFAIP3、MAP2K6在沉默APE-1的肝癌细胞Hep 3B中低表达。TNFAIP3、MAP2K6在临床肝癌组织样本中高表达,且APE-1和TNFAIP3,APE-1和MAP2K6表达均呈正相关(P<0.001)。结论APE-1是肝癌发生发展中关键的抗肿瘤基因,其可能通过影响TNF信号通路发挥作用。

宽峰或双峰聚乙烯金属茂催化剂的研究

为提高茂金属聚乙烯的加工性能,选择两种茂金属催化剂APE-1和SP-2在实验室混合使用,由于它们催化乙烯聚合的活性相似,动力学行为也相似,适于复配进行乙烯均聚和共聚。在两种催化剂SP-2和APE-1复配的摩尔比为20时,随1-己烯加入量的提高,所得聚合物的相对分子质量分布有所加宽,且出现了双峰分布。

细胞内蛋白质是怎样被分解的——2004年诺贝尔化学奖简介

一年一度的诺贝尔化学奖备受社会关注。2004年诺贝尔化学奖分别奖给以色列科学家阿龙·切哈诺夫和阿夫拉姆·赫什科以及美国科学家欧文·罗斯,以表彰他们发现并在分子水平上认识细胞是怎样调控细胞内某些蛋白质作为靶分子,在特定时间和特定场所被分解的(这一过程被称为泛素调节蛋白水解作用)。为了帮助广大读者了解他们的科学成就,本期特刊登了陕西师范大学吴祺教授的《细胞内蛋白质是怎样被分解的——2004年诺贝尔化学奖简介》一文。