柱花草SgPAL3基因启动子的克隆及上游转录因子的筛选

柱花草(Stylosanthes spp.)是热带地区广泛种植的重要草种,炭疽病是危害柱花草的严重病害,柱花草SgPAL3基因具有抗炭疽菌的功能。本研究对启动子区域-2 000~0 bp,-1 500~0 bp序列分别构建诱饵载体并检测自激活,结果表明500 ng·mL^(-1)金担子素(Aureobasidin A,AbA)可以抑制两种诱饵载体的自激活。利用Gateway技术构建了柱花草响应炭疽菌的酵母cDNA文库,其容量为1.20×107,插入片段主要分布在750~2 000 bp,重组率为100%;利用酵母单杂交技术,筛选与SgPAL3基因启动子互作的转录因子,并验证了3个转录因子(SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8)与SgPAL3启动子的互作关系;qRT-PCR分析表明,SgASIL2,SgHAT5和SgZHD8均响应炭疽菌的侵染,说明它们可能调控柱花草对炭疽病的抗性。本研究为进一步解析SgPAL3响应炭疽菌侵染的转录调控机制奠定了基础。

蜡梅CpBEAT3启动子克隆及其互作蛋白的初步验证

苯甲醇乙酰基转移酶(benzyl alcohol acetyltransferase,BEAT)能够以苯甲醇和乙酰辅酶A(acetyl-CoA)为底物催化合成乙酸苄酯,是植物乙酸苄酯生物合成代谢途径下游的关键酶。CpBEAT3是蜡梅叶中调控乙酸苄酯生物合成的关键基因,为了解析其在蜡梅乙酸苄酯生物合成中的转录调控机制,本研究克隆得到了CpBEAT3基因启动子区序列,使用生物信息学软件预测分析了该基因核心启动子区、顺式作用元件、CpG岛等结构特征,并通过酵母单杂交技术筛选可能与CpBEAT3结合的上游调控因子。结果表明,2115 bp的CpBEAT3核心启动子区可能位于-1844~-1794 bp处,有一个位于-1869~-1459 bp处且长度为410 bp的CpG岛,含有多种与光响应、激素调节、胁迫响应相关的顺式作用元件及多个转录因子结合位点。通过酵母单杂交技术筛选获得1个MYB类的转录因子,可以与CpBEAT3启动子结合。

汉族人群Toll样受体3基因启动子区rs128912单核苷酸多态性与白内障的关系

目的:分析汉族人群Toll样受体3(TLR3)基因启动子区rs128912单核苷酸多态性(SNP)与白内障的关系。方法:选取2019-06/2021-06我院收治的白内障患者263例作为研究组,晶状体脱位患者150例作为对照组。采用免疫印迹法(Western blotting)检测两组患者晶状体前囊膜组织中TLR3蛋白表达情况,采用直接测序法分析TLR3基因启动子区rs128912位点多态性,采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测不同基因型患者外周血TLR3 mRNA表达情况。结果:研究组患者前囊膜组织中TLR3蛋白相对表达水平高于对照组(P<0.05)。研究组和对照组患者TLR3基因启动子区rs128912位点基因型(AA、AT、TT)频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,且两组患者间TLR3基因启动子区rs128912位点基因型(AA、AT、TT)频率和等位基因(A、T)频率均有差异(P<0.05)。研究组中TT基因型患者外周血TLR3 mRNA相对表达水平均高于AA和AT基因型患者(P<0.05)。结论:白内障患者晶状体前囊膜组织中TLR3蛋白表达明显上调,且TLR3基因启动子区rs128912位点多态性与汉族人群白内障易感性有关,携带TT基因型者更易发生白内障。

工业大麻腺毛发育基因CsMIXTA启动子克隆及功能分析

CsMIXTA在调控大麻雌性花器官中腺毛的发生和发育中发挥重要作用。为了研究CsMIXTA基因的表达调控,对CsMIXTA基因上游2199 bp启动子序列进行了克隆。通过PlantCARE预测发现,该启动子序列具有多个胁迫响应元件与光响应元件。根据预测的响应元件分布情况,扩增获得5个5′端缺失的启动子片段。用克隆的启动子全长和缺失片段分别构建融合GUS基因的表达载体,并将其瞬时转化到烟草叶片和工业大麻糖叶中。通过GUS染色观察发现,CsMIXTA启动子的核心区域位于–393~–99 bp之间,包含赤霉素响应元件TATC-box和转录起始元件TATA-box。通过LUC荧光素酶表达发现,CsMIXTA启动子的核心区域具有转录活性。研究还发现,CsMIXTA基因在工业大麻糖叶的腺毛中特异性表达。对启动子进行胁迫响应分析的结果显示,低温、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)都能增强该启动子的活性。这些结果为CsMIXTA基因调控机制研究奠定了重要基础。

苦荞黄烷酮3-羟化酶基因FtF3H及其启动子的克隆与功能分析

【目的】克隆苦荞FtF3H基因及其启动子序列,探究该基因的生物学效应及启动子对环境因素与激素的响应。【方法】基于苦荞基因组和转录组数据克隆FtF3H基因及其启动子,对二者进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术检测FtF3H对MeJA、ABA和光处理的响应,进一步利用转基因拟南芥技术,分析FtF3H的过表达对黄酮合成的影响。【结果】苦荞FtF3H基因DNA序列长2034 bp,包括2个内含子和3个外显子;其ORF序列为1104 bp,推导的FtF3H蛋白含367个氨基酸残基,归类于2-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族且具有典型的植物F3H的分子特征。启动子PFtF3H在核心启动子基序外,还含有数目众多的光应答元件和激素响应元件,qRT-PCR检测结果显示,PFtF3H可强烈响应ABA、MeJA和光照的诱导。转基因拟南芥中,FtF3H的过表达可引起总黄酮含量显著增加(P<0.05),黄酮合成相关酶基因,AtANS、AtDFR和AtF′3H等的表达量显著上调(P<0.05),而拟南芥内源的AtF3H表达受到抑制(P<0.05)。【结论】苦荞FtF3H基因是一个典型的植物黄烷酮3-羟化酶,其表达受到激素和光的调控,在拟南芥中的过表达可促进黄酮的合成和积累。

陆地棉GhNCED3基因启动子克隆及其功能初步分析

为探究棉花(Gossypium hirsutum L.)GhNCED3启动子的功能,从陆地棉新陆早22号中克隆GhNCED3启动子。利用Plant CARE在线软件分析GhNCED3启动子上的顺式作用元件,构建ProGhNCED3∷GUS-p1300融合表达载体。采用浸花法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana),对转基因阳性植株筛选验证。为进一步探究GhNCED3启动子的特性,在外源脱落酸处理下分析转ProGhNCED3∷GUS株系GUS基因表达量。同时对干旱胁迫处理前后的转基因株系进行GUS组织化学染色、GUS基因表达量检测及GUS酶活性测定。启动子序列分析结果表明,GhNCED3启动子上含有参与脱落酸信号转导途径的ABRE元件和响应干旱胁迫的HD-box元件。在T_0代转基因株系中扩增GhNCED3启动子片段结果表明,GhNCED3启动子已整合至拟南芥染色体中。T_2代转基因株系GUS组织化学染色及GUS基因表达量检测结果表明,克隆的1 581 bp GhNCED3启动子具有转录活性,能够驱动GUS基因在拟南芥中稳定遗传表达。在不同浓度脱落酸处理下,转基因株系中GUS基因表达量上调。干旱胁迫下GhNCED3启动子转录活性鉴定结果表明,干旱处理后GUS染色区域、程度、GUS表达量及GUS酶活性均增加。表明1 581 bp GhNCED3启动子的转录活性受脱落酸和干旱胁迫诱导。

水稻OsSPL3启动子克隆及表达分析

OsSPL转录因子在水稻(Oryza sativa)根系、叶片、花器官、穗等发育与逆境响应过程中起重要作用。本文通过对OsSPL3启动子的分析,探究了OsSPL3转录因子在水稻中的表达模式及其对干旱胁迫的响应方式。利用PLACE和Plant CARE在线软件分析OsSPL3启动子区的顺式作用元件,并构建OsSPL3启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase, GUS)基因的重组表达载体,转化‘中花11’(ZH11)水稻愈伤组织,筛选获得阳性转基因植株,且对p OsSPL3-GUS转基因植株的GUS表达活性以及在干旱胁迫与脱落酸(abscisic acid, ABA)处理下的表达方式进行检测。启动子分析结果表明,OsSPL3启动子区除包含必要的转录起始核心元件与光响应元件外,还包括3个MYB参与的干旱诱导元件、3个赤霉素响应元件、2个厌氧诱导必需作用元件、1个低温响应作用元件、1个胚乳表达调控元件、1个玉米醇溶蛋白代谢调控元件和1个分生组织表达相关调控元件。GUS染色结果显示,GUS基因在新生叶片、茎鞘、胚芽鞘等幼嫩组织及根冠、分生区、伸长区等根系旺盛生长部位中表达活性较高。此外,干旱胁迫能明显增强转基因水稻叶片与根系的GUS活性。本研究结果表明,OsSPL3转录因子在水稻种子萌发后的胚芽鞘生长、新叶发生、根系延伸等器官发育与茎鞘伸长等过程中发挥调控作用,同时,OsSPL3转录因子还参与水稻干旱胁迫响应过程。

大黄鱼slitrk3基因启动子克隆及转录调控分析

神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制,可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析,并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件,采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示,Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性;大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBPα和C/EBPβ等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示,大黄鱼slitrk3基因启动子区域的−1970—−1614 bp、−1210—−667 bp存在正调控元件,−1614—−1210 bp、−667—−376 bp、−376—−147 bp存在负调控元件,推测−147—+16 bp为核心启动子。

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列生物信息学分析

为解析鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列的结构特征及其转录调控机制,本研究基于NCBI数据库中鸡EDN3基因5′侧翼区与外显子1共计2052 bp核苷酸序列,利用不同在线软件对其核心启动子区域、顺式作用元件、转录因子结合位点及CpG岛等结构进行生物信息学预测分析,并通过DNASTAR Lasergene 17.3和MEGA 5.0软件进行不同物种EDN3基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建。结果表明:鸡EDN3基因起始密码子上游592~2000 bp为可能的候选核心启动子区;5′侧翼区633 bp和1547 bp存在2个潜在的转录起始位点T和A;该基因启动子区存在2个CAAT-box、3个GC-box、6个TATA-box、9个E-box和3个CpG岛结构域。综合多种在线软件预测,鸡EDN3基因启动子区存在Sp1、C/EBPα和NF-1等转录因子结合位点。鸡EDN3基因启动子区序列与环颈雉、鹌鹑、岩雷鸟、棕硬尾鸭、凤头潜鸭、山羊、绵羊、牛、猪和人的相似性为38.8%~90.3%;系统进化树表明,鸡与鹌鹑亲缘关系最近,与猪亲缘关系最远。研究结果为进一步探明鸡色素沉积关联EDN3基因的转录调控机制提供了理论依据。

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP(SEPALLATA)类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、Box I和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE-motif以及胁迫响应元件HSE、TC-richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

务川黑牛STAT3基因启动子区SNPs与生长相关性状的关联分析

为筛选STAT3基因启动子区SNPs及研究其对启动子功能元件和体尺性状的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点,PCR-RFLP进行验证和基因分型,并利用114头务川黑牛个体分析SNPs位点与8个体尺性状的相关性。结果表明:STAT3基因5′调控区存在7个新SNPs位点,分别为:G-449A、C-341A、A-322G、C-246A、G-240A、C-225T、A-103T,提交SNP数据库得到登录号。生物信息学软件预测得到STAT3基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生。多态性位点对转录因子结合位点有显著影响,但并不改变CpG岛大小。关联性分析结果表明,A-322G对务川黑牛体重有极显著影响(P<0.01),A等位基因为有利等位基因。与AA或GG纯合基因型相比,AG基因型个体有更出色的体重性状。A-322G可能作为影响肉牛生长性状的重要功能性SNP,STAT3基因可能作为肉牛选种选育的候选基因,研究结果为进一步确定STAT3基因功能奠定试验基础。

马铃薯SGT3基因表达及其启动子功能分析

鼠李糖转移酶(rhamnosyltransferase SGT3)是植物糖苷生物碱合成的关键酶,它主要调控α-茄碱和α-查茄碱从其β形式的转化。本文研究马铃薯栽培种SGT3基因的表达特点及其启动子的功能。实时定量PCR结果发现在红光照射24h后,SGT3的表达量是黑暗处理的26.8倍,说明红光显著诱导了SGT3的表达;为进一步分析该基因的光调控机理,本项研究克隆到SGT3上游长度为2449bp的启动子序列,通过分析发现该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游-152bp,同时确定了该启动子核心序列及上游增强子、抑制子序列,受病原菌、损伤、干旱、ABA激素及一系列光调控的顺式元件。构建不同长度(349,572,979,1312和1870bp)的该启动子驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果证明,不同长度的SGT3启动子都可以启动GUS表达,但没有CMV35S启动的GUS表达量高;其中在P572和P979的表达强度较高,这可能与该片段含有启动子的正调控元件(GATA BOX,5′UTRPY-RICH STRETCH)有关,GUS表达强度在P1312和P1870中明显减弱,预测到该区段存在抑制基因表达的负调控元件(WRKY710S);SGT3启动子的组织特异性实验表明GUS染色主要集中在烟草叶片的叶脉部分,茎中的表皮、韧皮部及木质部,但髓部几乎不表达,根中主要分布在根冠、分生区以及维管束组织中。上述结果为将来研究SGT3在糖苷生物碱合成过程中的调节功能提供了依据。

一种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL-PCR技术

以小麦基因组DNA为模板,用一种改良热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)技术克隆到全长为1748bp的小麦GLP3基因的上游侧翼序列。测序结果表明,TATA-box位于基因转录起始位点CAT-box上游-27bp处;CAAT-box位于CAT-box上游-163bp处;ATG位于CAT-box下游94bp处,5'UTR(非编码区)序列全长93bp,表明该序列为小麦GLP3启动子序列。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。

小黑杨CYCD3;3基因启动子序列分析及其在拟南芥中的表达

通过相关网站及生物信息软件对Poptr:CYCD3;3基因启动子序列进行详细分析,从小黑杨(Populus)叶片总DNA中克隆到2 000 bp的目的片段,构建植物表达载体(p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3),并利用浸花法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana);通过抗性筛选和分子检测结果显示,p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3基因已经整合到拟南芥基因组中。同时对获得的转基因幼苗进行GUS染色并观察,其基因表达模式主要集中在植物分生组织中,由此表明Poptr:CYCD3;3调控CYCD3;3基因在细胞分裂中发挥作用。

水稻重复序列RRD3在转基因植物中的启动子功能

来源于水稻 (OryzasativaL .)的一个 82 0bp多拷贝重复序列RRD3 ,含有植物启动子TATA_box、CAAT_box等特征保守基元。用RRD3取代Ti载体pBI12 1中的CaMV 35S启动子 ,通过植物转化鉴定RRD3的启动子功能。组织化学分析表明 ,根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)LBA44 0 4转化后的烟草 (Nico tianatabacumL .)再生植株和水稻愈伤组织都显示了gusA基因的表达 ,并且发现转基因烟草茎端组织的GUS活性比其他部位强。这些结果提示RRD3在转化的植物中行使了启动子功能 ,该DNA片段中启动子核心功能序列的确定正在进行中。

拟南芥VHA-c3启动子的GUS基因融合表达

VHA-c3基因是拟南芥液泡H+-ATPasec亚基的5个同源基因之一,已有研究结果表明其与植物抗非生物胁迫有关。在克隆不同长度VHA-c3基因上游调控序列的基础上,利用GUS报告基因,研究了VHA-c3基因的植物组织及器官定位。结果表明:VHA-c3起始密码子上游772bp的序列内存在着VHA-c3基因的基本启动子元件,可指导基因组成型表达在拟南芥的叶片、表皮毛、叶柄、根、雄蕊、柱头和萼片;在VHA-c3起始密码子ATG上游2812bp～2234bp片段和1496bp～772bp片段中各存在一个负调控元件,在2234bp～1496bp片段中存在一个正调控元件,它们的存在可控制基因在气孔中的表达。

大豆脂肪氧化酶-3基因(Lox3)启动子的克隆及其瞬时表达分析

利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离脂肪氧化酶-3基因启动子片段Lox3p。PLACE在线启动子预测工具分析表明:序列中含有多种典型的种子及胚特异性表达元件。将克隆得到的Lox3p片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-Lox3p。通过农杆菌介导法在大豆种子中进行瞬时表达,GUS组织化学染色及荧光测定都显示出Lox3p驱动GUS基因表达的强度高于CaMV35S启动子。结果表明,该Lox3p启动子片段具备一定的胚特异表达特性,为探明大豆脂肪氧化酶-3基因启动子胚特异表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。

runx3启动子区域甲基化在急性白血病中意义的初步研究

为了探讨runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病发病机制中的作用及其临床意义,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测CHRF、U937、K562细胞系及40例急性白血病患者和10例正常人骨髓或外周血runx3基因启动子区域的甲基化情况,并用RT-PCR方法检测各系runx3基因的表达情况。结果发现,健康人及细胞系中均未检测到甲基化,而检测到该基因的表达;40例急性白血病患者甲基化检测阳性率35%(14/40),明显高于正常人0%,差异有统计学意义(p<0.05),其中AML30.43%(7/23),ALL41.18%(7/17),p>0.25,两者无明显差异。甲基化检测阳性患者均未检测到runx3基因的表达。存在runx3启动子区域甲基化患者化疗前骨髓原始细胞数均高于runx3启动子区域未甲基化患者(p<0.01),而且首次化疗后完全缓解率低于未甲基化者(p<0.05),差异有显著性。结论:runx3基因启动子区域甲基化在急性白血病的发病机制中起一定的作用,其检测对估计白血病预后具有临床意义。