群体感应核心调控子OpaR和AphA对副溶血弧菌生物学功能及毒力基因调控的研究进展

群体感应(quorum sensing,QS)是细菌间一种常见的信号传递机制,可影响细菌的生物学功能与毒力基因表达。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)广泛分布于海洋环境中,是一种对全球水产养殖业产生严重影响的弧菌。OpaR和AphA是副溶血弧菌QS系统中的两个核心调控子,其中OpaR主要在高细胞密度(high cell density,HCD)下,AphA主要在低细胞密度(low cell density,LCD)下发挥调控作用。调控子OpaR和AphA参与生物膜形成、运动能力等多种生物学功能的调控,在副溶血弧菌致病过程中发挥重要作用。本文主要阐述了处于不同菌体密度时,副溶血弧菌QS核心调控子OpaR和AphA及相关基因转录表达情况,及其对菌体生物学功能与毒力基因表达调控情况,同时进一步从分子层面解析了副溶血弧菌的致病机制,以期为防控副溶血弧菌病提供参考。

江苏某肉鸡屠宰场弯曲菌耐药性及aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇分布分析

为了解江苏某肉鸡屠宰场弯曲菌分离株耐药性及氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的分布特点,本研究采用药敏纸片法对肉鸡屠宰场117株弯曲菌分离株进行9大类26种抗生素的耐药性检测。结果显示,117株菌对链霉素和卡那霉素耐药的菌株占93.2%(109/117),对头孢氨苄耐药菌株占96.6%(113/117),对氟喹诺酮类药物耐药菌株占比均大于89.7%(105/117),对碳青霉烯类及氯霉素类药物较为敏感,且94%(110/117)的菌株表现出多重耐药性。采用PCR方法检测氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的分布情况。结果显示,有90株弯曲菌(空肠弯曲菌17、结肠弯曲菌73)检出了aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇。进一步采用琼脂稀释法测定了其中20株aadEsat4-aphA-3阳性菌对氨基糖苷类5种药物的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,20株aadE-sat4-aphA-3基因簇阳性弯曲菌中共有12株对庆大霉素耐药,MIC值最高为256μg/mL,共有11株对受试的5种氨基糖苷类药物均耐药,且大部分菌株对阿米卡星、妥布霉素的MIC值≥256μg/mL。表明aadE-sat4-aphA-3基因簇阳性弯曲菌对氨基糖苷类药物有较强的耐药性。综上所述,江苏某肉鸡屠宰场弯曲菌对氟喹诺酮类及氨基糖苷类部分药物耐药性较高且多重耐药现象严重,空肠弯曲菌与结肠弯曲菌中均有aadE-sat4-aphA-3耐药基因簇分布,且部分该耐药基因簇阳性菌株对氨基糖苷类药物耐药性较强。本研究为畜禽养殖临床用药指导提供了参考依据,并为弯曲菌氨基糖苷类药物耐药机理的进一步研究奠定基础。

实时荧光定量RT-PCR检测鹿源致病性大肠杆菌aphA基因mRNA表达水平

从临床分离的20株鹿源耐氨基糖苷类药物大肠杆菌中选取2株高度耐药菌,4株中度耐药菌和1株低度耐药菌,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测编码磷酸转移酶aphA基因mRNA的表达水平。结果表明,2株高度耐药株Ct值(Cycle threshold,即反应管内荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)最小,平均为23.40,但这2株之间Ct值也存在着差异;4株中度耐药株之间差异不大,Ct值平均为27.20;而1株低度耐药株Ct值最大,为31.53。这说明不同耐药程度的7株菌在mRNA表达水平上存在差异,且aphA基因的转录、表达水平与耐药水平成正相关。

沙门菌中GcvB sRNA可调控aphA mRNA

aphA编码B类酸性磷酸酶,本研究旨在将沙门菌中aphA以lacZ进行替换,获得△aphA::lacZ,从而了解GcvB sRNA对aphA mRNA的调控作用。通过使用λred同源重组、FLP/FRT重组系统、电转导等技术构建相应缺失菌株,并进行β-半乳糖核苷酸酶活实验与qPCR鉴定相应表达量变化。在qPCR实验中,相较于缺失wt、GcvB及其R1、R2、R3后,△aphA::lacZ的aphA相对转录量下降;而在β-半乳糖核苷酸酶活实验中,相较于△aphA::lacZ,缺失GcvB后变化并不明显,而缺失R1、R2、R3后,β-半乳糖苷酶酶活均有上升,分别为244.47%、230.67%、305.06%。以上结果表明,GcvB sRNA对aphA mRNA具有一定的调控作用。

我国水的细菌总数检验法与APHA方法的实验比较

我国水的细菌总数检验法与ＡＰＨＡ方法的实验比较王豫林王红安永群刘晓朋细菌总数作为判断水质被污染程度的标志，在水的卫生评价中具有重要意义。我国现行国家标准检验方法（简称ＧＢ法）〔１，２〕均采用营养琼脂培养基，将水样培养于３７℃，２４ｈ后进行计数。由美国...

蓝藻细菌光敏色素AphA(26-320)的体内重组与摇瓶发酵优化

将蓝藻PCC7120细菌光敏色素缺失突变体AphA(26-320)基因和血红素氧化酶(ho1)及胆绿素还原酶(PcyA)的基因共同转化E.Coli BL21(DE3),在IPTG的诱导下实现体内共同表达,进行体内重组,生成了具有可逆光致变色活性的AphA(26-320)-PCB.对重组菌的培养条件,诱导条件进行优化,确定适合合成AphA(26-320)-PCB的培养时间,诱导温度,摇床振荡速度等.

AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成

【目的】综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制。【方法】利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(ΔaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测ΔaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取ΔaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入ΔaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。【结果】表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上。【结论】AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一。

72株纹带棒状杆菌对抗菌药物敏感性及其感染或定植患者的临床特征

目的 了解临床分离的纹带棒状杆菌对抗菌药物的敏感性及其感染或定植患者的临床特征。方法 收集福建医科大学附属泉州第一医院2020年7月-2022年9月临床分离纹带棒状杆菌72株,采用肉汤微量稀释法检测细菌对18种抗菌药物的敏感性。PCR扩增检测喹诺酮类耐药决定区相关基因gyrA并进行测序以分析氨基酸突变位点,PCR扩增核糖体甲基化酶基因ermX和氨基糖苷修饰酶基因aphA1并进行测序分析。病史资料分析纹带棒状杆菌感染或定植患者的临床特征。结果 药敏试验结果显示,所有菌株对万古霉素、利奈唑胺和达托霉素均100%敏感,对头孢曲松、环丙沙星及莫西沙星均100%耐药,对青霉素(87.5%)、头孢吡肟(95.8%)、美罗培南(95.8%)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(90.3%)、红霉素(98.6%)和克林霉素(98.6%)的耐药率较高,对庆大霉素(25.0%)、四环素(30.6%)和利福平(23.6%)耐药率较低。PCR及DNA测序结果显示,3株纹带棒状杆菌发生gyrA基因单点突变(Ser87Val),67株发生双突变(Ser87Phe、Asp91A1a或Ser87Tyr、Asp91Ala),2株发生三位点突变(Ser87Phe、Ala88Pro和Asp91Ala),其中三位点突变是本研究首次发现的突变模式。所有的纹带棒状杆菌均检出ermX基因,aphA1基因检出率为43.1%。病史资料结果显示,72株纹带棒状杆菌主要分离自ICU(占65.2%),标本来源以下呼吸道标本为主(占91.6%),患者平均年龄(68.0±15.3)岁,感染和定植患者比例分别占72.2%(52/72)和27.8%(20/72),两组患者在住院时长≥28 d、合并脑出血、意识障碍及病情恶化方面差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 该院临床分离的纹带棒状杆菌均为多重耐药菌,感染患者预后相对较差。

副溶血弧菌lux报告基因系统的建立与应用

目的:建立副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,为后续研究基因转录调控机制奠定基础。方法:采用PCR扩增opaR的启动子区序列,并将其克隆入pBBRlux质粒中,构建重组质粒opaR-lux。将opaR-lux重组质粒分别转入野生株(WT)、opaR突变株(ΔopaR)和aphA突变株(ΔaphA)中,检测特定培养条件下三者发出的冷光值(Lux)以及在600 nm处的吸光度值(OD600),以“Lux/OD600”表示单位OD600下的相对平均冷光单位(relative light unit,RLU)。通过比较各菌株的RLU大小,判断OpaR和AphA对opaR的调控关系,以检验实验平台的稳定性。结果:成功构建出带有opaR的pBBRlux重组质粒;在低密度(OD600<0.4)时,AphA负调控opaR的转录,当细菌达到高密度(OD600=0.8)时,AphA则对opaR的转录不起调控作用;在细菌从低密度生长到高密度(即OD600<0.8)中,OpaR对自身的转录存在负调控作用。结论:成功建立了副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,用于后续转录调控机制的研究。

AphA蛋白对副溶血弧菌vopT的转录调控研究

【目的】研究副溶血弧菌AphA对vop T的转录调控机制。【方法】提取野生株(WT)和aphA突变株(ΔaphA)的总RNA,采用引物延伸实验研究vop T的转录起始位点,并根据产物的丰度差异判断AphA对其调控关系。分别将WT和ΔaphA的总RNA逆转录成c DNA,利用实时定量RT-PCR进一步研究AphA对靶基因的调控关系。将vop T的启动子区克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔaphA中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定AphA对vop T的调控关系。PCR扩增靶基因整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,利用凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-AphA对靶基因启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】vop T只有一个转录起始位点A(-86),且其转录活性受AphA的间接抑制。RT-PCR和EMSA结果显示AphA对vtrA的转录也具有间接的抑制作用。【结论】AphA间接抑制vop T转录,且该间接抑制作用与VtrA无关。

我国607株不同宿主来源弯曲菌耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3分布分析

目的了解不同宿主来源弯曲菌对氨基糖苷类抗生素的耐药现状,确定耐药菌株中氨基糖苷类耐药基因簇aadE-sat4-aph A-3的分布,并初步了解耐药菌株的菌型特征。方法利用琼脂稀释法分析不同宿主来源菌株针对链霉素最小抑菌浓度(MIC),对耐药的221株菌通过聚合酶链反应筛查氨基糖苷类耐药基因簇aad E-sat4-aph A-3的分布情况。选取不同来源共100株耐药菌株进行多位点序列分型分析并进行聚类分析,获得耐药菌株的菌型特征及遗传相关性。结果 607株弯曲菌中共筛查到221株(36.41%)链霉素耐药株(MIC≥4μg/ml),其中腹泻患者来源菌株耐药率33.33%(78/234)、鸡来源菌株耐药率35.14%(123/350)、猪来源菌株耐药率86.96%(20/23)。空肠弯曲菌耐药率14.37%(51/355),结肠弯曲菌耐药率67.46%(170/252)。24株(10.86%)链霉素耐药弯曲菌中筛查到aad E-sat4-aph A-3耐药基因簇,分别来自腹泻患者14株、鸡4株、猪6株。100株耐药菌株共分为58种ST序列型。结论结肠弯曲菌链霉素耐药率明显高于空肠弯曲菌,猪源弯曲菌耐药率显著高于人源和鸡源,空肠弯曲菌与结肠弯曲菌中均筛查到aad E-sat4-aph A-3耐药基因簇。

副溶血弧菌基因回补实验方法的建立与应用

目的建立以pBAD33质粒为载体的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)基因回补实验平台。方法 PCR扩增aphA和opaR的整个ORF区序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,构建重组质粒。分别将重组质粒转入到ΔopaR和ΔaphA中(分别代表opaR和aphA的突变株),以构建出相应的回补株C-ΔaphA和C-ΔopaR。分别在aphA和opaR基因内设计特异性引物,采用RT-PCR方法,验证在相应的回补突变株中aphA和opaR是否转录。利用引物延伸实验研究野生株(WT)、ΔopaR、ΔaphA、C-ΔaphA和C-ΔopaR中mfpA(aphA负调控,opaR正调控其表达)的相对RNA水平。结果 aphA和opaR在相应的回补株中发生转录;且mRNA水平与野生株一致。结论成功建立了以pBAD33质粒为载体的VP基因回补方法,并得到应用。

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。

“四冲穴”阴中隐阳刺法联合Schuell语言训练对缺血性脑卒中后失语的疗效观察

目的:探讨"四冲穴"阴中隐阳刺法联合Schuell语言训练治疗脑卒中后失语的疗效。方法:脑卒中后失语患者随机分为对照组38例及治疗组36例。对照组单纯采用Schuell语言训练,治疗组采用"四冲穴"阴中隐阳法配合Schuell语言训练,共4周。结果:两组患者治疗总疗效比较,有显著性差异(P<0.05)。治疗组与对照组失语症患者治疗后比较,在口语表达、阅读能力方面有显著性差异(P<0.01);在日常生活语言沟通能力评分中有显著性差异(P<0.01)。结论:"四冲穴"阴中隐阳刺法联合Schuell治疗缺血性卒中后失语有较好效果,值得进一步推广。

骨碎补对α-糖苷酶活性的影响

目的研究骨碎补对α-糖苷酶活性的影响。方法骨碎补提取物加入α-淀粉酶和α-麦芽糖酶不同微量反应体系中,分别用Bernfeld法、GOD法测其酶活。结果骨碎补水提物和浸膏对α-糖苷酶中的α-麦芽糖酶活性均有明显的抑制作用,存在量效关系,呈可逆性混合型抑制类型。结论骨碎补水提物、浸膏是对α-糖苷酶起抑制作用的主要部位。

词联导航训练法联合经颅直流电刺激改善失语症言语流畅度及命名能力的临床观察

目的:探讨词联导航训练法(word association navigation training,WANT)结合经颅直流电刺激(tDCS)改善慢性非流畅性失语症患者言语功能的治疗方案。方法:16例非流畅性失语症患者随机分为真刺激组(8例)和伪刺激组(8例)。真刺激组tDCS阳极置于左侧Broca区,阴极置于对侧肩部,电流强度为1.0mA,2次/天,20min/次,连续10d。伪刺激组每次tDCS刺激30s后停止。两组同时实施WANT训练。治疗前后进行西方失语症成套测试(WAB)、训练图片和未训练图片命名测试。结果:治疗前后两组WAB失语商(WAB-AQ)和图片命名测试得分均有显著提高(P<0.05)。治疗后真刺激组训练图片命名得分和WAB中言语流畅度得分显著提高(P<0.01)。未训练图片命名测试得分和WAB-AQ较伪刺激组改善明显(P<0.05)。结论:词联导航训练法结合tDCS能更显著地改善慢性非流畅性失语症患者的言语流畅度和命名能力。

血清CRP与新生儿黄疸TBIL和IBIL水平的相关性分析

目的探讨血清C反应蛋白(CRP)与新生儿病理性黄疸患儿总胆红素(TBIL)和间接胆红素(IBIL)水平的相关性。方法选取2016年3月至2018年10月期间湖州中心医院收治的80例新生儿黄疸患儿,其中40例病理性黄疸患儿为病理组,另外40例生理性黄疸患儿为生理组,选取同期80例健康新生儿为对照组。所有患儿均按照常规进行对症治疗,分析各组新生儿的IBIL、直接胆红素(DBIL)、TBIL、甲胎蛋白(AFP)和CRP水平。结果治疗前的IBIL、DBIL、TBIL、AFP、CRP水平,病理组患儿均显著高于对照组新生儿(t值分别为4.384、4.983、5.283、5.233、5.495,均P<0.05);生理组患儿均显著高于对照组新生儿(t值分别为5.834、5.322、5.982、5.331、5.463,均P<0.05);生理组患儿均显著低于病理组患儿(t值分别为5.485、6.332、4.938、6.384、6.773,均P<0.05)。病理组患儿治疗前的IBIL、DBIL、TBIL、AFP、CRP水平均显著高于治疗后(t值分别为32.394、14.332、33.956、31.029、30.284,均P<0.05)。新生儿黄疸患儿体内AFP水平与IBIL、DBIL、TBIL水平均呈正相关(r值分别为0.463、0.355、0.673,均P<0.05),CRP水平与IBIL、TBIL水平均呈正相关(r值分别为0.482、0.394,均P<0.05)。结论新生儿病理性黄疸患儿体内的CRP和AFP水平会随着IBIL和TBIL水平的提高而异常升高,对该类患儿的诊断及预后均有较好的参考价值。

群体感应系统核心调控子对副溶血弧菌mshH基因的调控研究

【目的】探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控。【方法】提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(ΔaphA和ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究AphA和OpaR对mshH基因的转录调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;将mshH启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,并将其转入WT、ΔaphA和ΔopaR中,获得LacZ实验菌株,再通过LacZ报告基因融合实验研究AphA和OpaR对mshH基因的调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;PCR扩增mshH上游启动子区DNA序列,并纯化His-AphA和His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和DNase I足迹实验,研究体外条件下His-AphA和His-OpaR对靶基因启动子区DNA片段是否具有直接的结合作用以及具体的结合位点。【结果】mshH基因的表达水平随着培养时间的延长而升高;低细菌密度时,AphA抑制mshH基因的转录,但His-AphA对mshH启动子区DNA序列没有结合活性;高细菌密度时,OpaR对mshH基因的转录具有激活作用,His-OpaR对位于mshH基因的翻译起始位点上游–160至–80 bp和–58至–19 bp之间的DNA序列具有结合活性。【结论】低细菌密度时,AphA可能是通过间接方式抑制mshH基因的转录;高细菌密度时,OpaR直接结合到mshH调控区DNA片段上,并激活其转录。

副溶血弧菌密度感应系统调控exsA和exsD的分子机制

目的研究副溶血弧菌密度感应系统核心调控子AphA和OpaR对exsA和exsD的调控机制。方法提取野生株(WT)和调控子基因突变株(ΔaphA或ΔopaR)总RNA,采用引物延伸实验确定exsA和exsD的转录起始位点,并根据WT和突变株中引物延伸产物的丰度,判定AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系;将exsA和exsD的启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒无启动子区的β-半乳糖苷酶基因的上游,构建重组质粒,并将其分别转入WT、ΔaphA和ΔopaR中得到LacZ菌株,用β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测并比较各LacZ菌株中β-半乳糖苷酶活性的差异来判断AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系;PCR扩增exsA和exsD的上游调控序列,并表达纯化His-AphA和His-OpaR重组蛋白,利用凝胶阻滞实验(EMSA)探究重组蛋白是否可结合到exsA和exsD的上游调控序列上,并采用DNase I足迹实验鉴定具体的结合位点。结果引物延伸实验结果显示,exsA和exsD各有一个转录起始位点,分别为C(-440)和C(-105)(翻译起始位点为+1),且在低密度生长条件下,AphA可激活它们的转录活性,而在高密度生长条件下,OpaR抑制它们的转录活性,随后的LacZ报告基因融合实验进一步确证了这种调控关系。体外的EMSA和DNaseⅠ足迹实验结果表明,His-AphA和His-OpaR均不能与exsA和exsD启动子DNA序列结合。结论低密度生长时,AphA间接激活exsA和exsD的转录;高密度生长时,OpaR间接抑制exsA和exsD的转录。