基于PacBio Iso-Seq构建低温胁迫后中华蜜蜂工蜂全长转录组

【目的】中华蜜蜂Apis cerana cerana是东方蜜蜂Apis cerana在中国地区分布最广泛的亚种,在地理适应和生态多样性方面有显著优势。中华蜜蜂的低温适应性优于西方蜜蜂A.mellifera,可用于高海拔高山地区和冬季蜜源的采集,该性能在生产方面有重要作用,探究中华蜜蜂低温耐受性可有助于优良品系的筛选,为农业经济创造更大价值。【方法】收集分别在常温(25.0±0.2)℃(对照)和低温(4.0±0.2)℃下处理6 h时的中华蜜蜂3,10和21日龄工蜂6组样本,进行转录组二代测序(Illumina RNA-Seq)和全长转录组三代测序(PacBio Iso-Seq),利用二代测序数据对三代测序数据进行校正,基于高质量的测序数据对比NR,NT,Pfam,KOG/COG,Swiss-Prot,KEGG和GO数据库,对新转录本和新基因进行功能注释。【结果】中华蜜蜂工蜂6组样本全长转录组测序分别获得71.17,42.76,58.82,53.45,40.33和42.79 Gb读段,平均N50达到205895 bp,质控后得到164194条一致性序列;通过比对到东方蜜蜂参考基因组可获得21519条新转录本,与中华蜜蜂物质代谢、神经系统和信号转导等密切相关,且不同日龄中华蜜蜂受低温胁迫后,物质代谢、细胞发育、寿命及神经发育等受到影响,同时还鉴定到28647条长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA),其中lincRNA和sense_intronic两种类型LncRNA的占比最多,分别为35%和45%。【结论】本研究利用矫正后的中华蜜蜂工蜂PacBio Iso-Seq转录组数据鉴定到大量未注释的新基因和新转录本,并对其进行了功能注释,分析了LncRNA的数量和类型,研究结果完善了东方蜜蜂参考基因组,为中华蜜蜂抗寒机制的探究提供了良好的数据背景。

利用意大利蜜蜂蛹为替代寄主繁育两种肿腿蜂

白蜡吉丁肿腿蜂Sclerodermus pupariae和松褐天牛肿腿蜂S.alternatusi是天牛和吉丁类害虫的重要天敌。本试验以意大利蜜蜂Apis mellifera蛹为替代寄主,研究了两种肿腿蜂寄生意大利蜜蜂蛹时其子代的发育过程和数量。结果表明,利用意大利蜜蜂蛹能成功繁育白蜡吉丁肿腿蜂和松褐天牛肿腿蜂。白蜡吉丁肿腿蜂对蛹的寄生率和羽化出蜂的寄主比例与松褐天牛肿腿蜂无显著差异。以意大利蜜蜂蛹为寄主时,两种肿腿蜂的产卵前期、卵期、幼虫期、蛹期和卵-成蜂发育历期均无显著差异。单头肿腿蜂雌蜂寄生1头蛹时,松褐天牛肿腿蜂的子代雌蜂数(17.61头/窝)和子代总数(18.83头/窝)均显著低于白蜡吉丁肿腿蜂的子代雌蜂数(25.10头/窝)和子代总数(26.52头/窝)。两种肿腿蜂的子代性比均具有显著的偏雌特征,松褐天牛肿腿蜂和白蜡吉丁肿腿蜂子代雄性比分别为6.83%和6.35%,其子代雄蜂数和雄性比例均无显著差异。综上所述,意大利蜜蜂蛹可作为白蜡吉丁肿腿蜂和松褐天牛肿腿蜂人工繁育的替代寄主,这为两种肿腿蜂的规模化繁育提供了参考。

中华蜜蜂HSC70-4基因表达特性的研究

组成型热休克蛋白70-4(heat shock protein 70 cognate 4,HSC70-4)是HSP70家族的重要成员,对蛋白质的正确折叠与转运有着重要意义。本研究以中华蜜蜂转录组数据中获得的HSC70-4基因序列为基础,通过对中华蜜蜂不同发育阶段、不同组织以及不同低温胁迫下的HSC70-4 m RNA表达量进行测定,以期为揭示该基因在中华蜜蜂生长发育和耐寒抗冻过程中的生理功能提供理论依据。结果显示,中华蜜蜂HSC70-4基因包含1923 bp的开放阅读框,编码641个氨基酸,蛋白分子量为70.4 k Da。中华蜜蜂HSC70-4氨基酸序列中包含3个HSP70家族的标签序列,其N端含有HSC70家族的GGXP四肽结构标志,C端包含EEVD结构。与膜翅目其它昆虫的氨基酸序列一致性在94%以上,具有较高的保守性。中华蜜蜂HSC70-4在成虫期的表达量显著高于幼虫期和蛹期(P<0.01),从幼虫期至10日龄成虫期呈逐渐上升趋势,但在15日龄至30日龄间呈现波动起伏。HSC70-4在中华蜜蜂不同组织中的表达存在显著差异(P<0.01),且在胸部高度表达,在足中中度表达,在其余组织中低度表达。中华蜜蜂HSC70-4的表达受低温胁迫的诱导,在低温胁迫2 h时其表达量最低,4 h时表达量最高。本研究结果表明中华蜜蜂HSC70-4在中华蜜蜂的生长发育过程中应对低温胁迫时发挥生理功能。

蜜蜂发育相关基因研究

蜜蜂是一种重要的授粉昆虫,也是研究人类疾病及社会行为的模式生物之一。由其基因组测序可知,蜜蜂基因组中(A+T)及CpG含量较高,其昼夜节律、RNAi和DNA甲基化基因更类似脊椎动物。先天免疫、表皮蛋白和味觉受体基因较少,气味受体基因较多。蜜蜂早期发育途径中的一些基因与果蝇的相似,功能却显著不同。本文综述了蜜蜂卵、幼虫、蛹和成虫期发育相关基因及其研究进展。

低温胁迫对意大利蜜蜂受精卵的孵化率和发育历期的影响

蜜蜂是典型的模式昆虫,也是重要的经济昆虫,温度对其发育有着重要的影响。本文研究了低温20℃处理不同时长对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica 0-66 h受精卵的影响。结果表明:低温处理导致意大利蜜蜂受精卵的孵化率下降,发育历期显著延长。低温对蜜蜂受精卵孵化率影响程度与卵龄关系较大。0-9 h卵龄对低温敏感,其次是12-24 h卵龄,36 h以上卵龄后则较耐低温。0-66 h的卵受低温影响后发育历期延长平均值与低温胁迫时间呈显著的线性正相关。低温对蜜蜂卵发育有影响,在蜜蜂饲养管理的早春增长阶段,需要加强蜂群的保温。

意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)在清除工蜂体内自由基的过程中起着关键的作用,其活性和基因表达量的高低与蜜蜂的寿命、抗病力有直接的联系,进而影响着蜂群的生产性能。本研究采用实时荧光定量PCR法研究意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica不同发育时期铜锌超氧化物歧化酶(copper zinc superoxide dismutase,CuZnSOD)、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)及过氧化氢酶(catalase,CAT)基因mRNA表达量的变化。实验分别在幼虫、蛹、成虫3个阶段5个时间点(产卵后5d的幼虫,产卵后14d的蛹,出房后1d,12d,32d的成虫)取样。结果表明,3个抗氧化酶基因在各个发育阶段均有表达,其中CuZnSOD和MnSOD mRNA的表达量在幼虫到蛹期和出房后12-32d两个阶段呈下降趋势,而都以出房后1d时表达量最大,蛹期表达量最小,且显著低于其他4个时期(P<0.05)。CuZnSOD基因mRNA的表达量在成虫阶段的下降趋势不明显,MnSODmRNA的表达量则显著下降(P<0.05);而CAT基因的mRNA表达量以蛹期最低,且其表达量随蜜蜂的生长发育稳定上升,在出房后12d和32d时表达量显著高于其他3个时期。这些研究结果在分子水平上揭示了抗氧化酶基因在蜜蜂不同发育时期的作用。

发育温度对蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响

【目的】本试验旨在研究不同发育温度对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂归巢能力及学习记忆相关基因表达的影响。【方法】选择3群群势一致的意大利蜜蜂,控制蜂王在一张经工蜂清理的工蜂巢脾中产卵48 h,之后移至孵化区。子脾即将封盖时,平均分成3块,分别放入33℃(Ⅰ组)、35℃(Ⅱ组)、37℃(Ⅲ组)的恒温恒湿箱中继续发育(相对湿度为75%±5%),每群为1个重复。工蜂羽化出房时,用不同颜色标记不同发育温度下羽化的工蜂,并放回原蜂王产卵群,测定其采集时期在1 000 m、2 000 m的回归率及不同日龄(刚出房,10日龄,20日龄)工蜂3个记忆相关基因[谷氨酸受体A型基因(Glu-RA)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1型基因(Nmdar1)、酪氨酸受体1型基因(tyr1)]的表达情况。【结果】结果表明:试验Ⅱ组和试验Ⅲ组发育的采集蜂在1 000 m和2 000 m处的回归率均显著高于Ⅰ组,但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组之间差异不显著;试验Ⅱ组和Ⅲ组刚出房工蜂、10日龄工蜂和20日龄工蜂的Glu RA和Nmdar1基因相对表达量显著高于试验Ⅰ组,但试验Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著;试验Ⅱ组刚出房工蜂的Tyr1基因相对表达量显著高于试验Ⅰ组与Ⅲ组,但试验Ⅰ组与试验Ⅲ组之间差异不显著,另外,各试验组10日龄和20日龄工蜂Tyr1基因相对表达量差异均不显著。【结论】过低发育温度会影响蜜蜂的归巢能力和记忆相关基因的表达。

中华蜜蜂幼虫发育期体蛋白质和体脂肪含量的初步分析

为了探索中华蜜蜂幼虫发育期体蛋白质和体脂肪含量的变化规律,以中华蜜蜂为试验材料,分别采集3日龄、6日龄、9日龄的蜂王幼虫、工蜂幼虫、雄蜂幼虫,检测其体蛋白质和体脂肪含量。结果表明:相同日龄的工蜂幼虫、雄蜂幼虫、蜂王幼虫体蛋白质和体脂肪含量均存在显著差异(P<0.05);工蜂幼虫和蜂王幼虫的体蛋白质含量随着日龄增长先减少后增加,雄蜂幼虫的体蛋白质含量随着日龄的增长而增加;工蜂幼虫和蜂王幼虫的体脂肪含量随着日龄增长先增加后减少,雄蜂幼虫的体脂肪含量随着日龄的增长呈下降趋势。