API2-MALT1融合基因在桥本氏甲状腺炎和甲状腺淋巴瘤中的表达及意义

目的探讨API2-MALT1融合基因在桥本氏甲状腺炎和甲状腺MALT及弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的表达情况,以了解融合基因表达与甲状腺MALT和弥漫大B细胞淋巴瘤发生及预后的关系。方法用逆转录降落PCR和巢式PCR结合检测8例桥本氏甲状腺炎、12例甲状腺MALT淋巴瘤和3例DLBCL中的API2-MALT1mRNA,5例反应性增生的淋巴结作为检测的阴性对照;通过临床病理和随访资料的分析了解融合基因对两种甲状腺淋巴瘤预后的影响。结果5例反应性增生的淋巴结和8例桥本氏甲状腺炎均未检出融合基因转录,15例甲状腺淋巴瘤检出2例有融合基因转录,1例为MALT淋巴瘤,1例为DLBCL,2例均伴有桥本氏甲状腺炎,临床分期为E期,无淋巴结累及。结论甲状腺MALT淋巴瘤中API2-MALT1融合基因mRNA的检出率虽较低,但不能完全排除API2-MALT1表达在桥本氏甲状腺炎向甲状腺淋巴瘤发展过程中的作用;具有融合基因转录的甲状腺淋巴瘤可能表现出更加惰性的发展过程。

RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性急性髓系白血病M2型预后的影响因素分析

目的 分析影响RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性的急性髓系白血病M2型(AML-M2)患者的预后因素。方法 回顾性分析阜阳市人民医院2016年10月至2022年8月收治102例AML-M2患者临床资料,将其中64例RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性患者设为阳性组,将38例RUNX1-RUNX1T1融合基因阴性患者设为阴性组,比较两组临床资料。采用Kaplan-Meier法,log-rank检验分析出对RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性患者总生存时间(OS)、无复发生存时间(RFS)有影响的因素,并应用Cox回归模型进一步分析影响预后的相关因素。结果 在RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性的AML-M2患者预后因素分析中,单因素结果显示,CD19阳性、诱导治疗后MRD下降>3个对数级、治疗后融合基因转阴是影响患者OS预后良好的因素(P<0.05),诱导治疗后MRD下降>3个对数级、融合基因转阴是影响患者RFS预后良好的因素(P<0.05);而白细胞≥20×109/L,C-Kit D816突变是影响患者OS和RFS预后不良的因素(P<0.05)。多因素生存分析显示,白细胞计数≥20×109/L、C-Kit D816突变、MRD下降>3个对数级、融合基因转阴是影响患者OS的影响因素;C-Kit D816突变、融合基因转阴是影响患者RFS的影响因素。结论 白细胞计数、C-Kit D816突变、MRD下降>3个对数级、融合基因转阴是影响RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML-M2患者预后的因素。

C型产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

儿童急性淋巴细胞白血病e2a-pbx1融合基因的表达水平与临床特点、早期治疗反应的相关性

为了探讨急性淋巴细胞白血病儿童初诊的e2a-pbx1融合基因表达水平与患儿临床特点和早期治疗反应的关系,采用实时定量聚合酶链反应定量检测45例患儿初诊e2a-pbx1表达水平和23例诱导缓解治疗第33天时微小残留病(minimal residual disease,MRD)水平;分析初诊e2a-pbx1表达水平、MRD水平与临床特点和早期治疗反应的相关性;比较MRD阳性与阴性患儿初诊e2a-pbx1表达水平及临床特点的差异。结果表明:初诊时e2a-pbx1表达水平与初诊时外周血幼稚细胞百分比呈正相关。23例诱导缓解治疗第33天MRD水平与初诊时各临床特点及e2a-pbx1表达水平均缺乏相关性。MRD阳性组初诊时e2a-pbx1表达水平高于阴性组,而患儿年龄显著低于阴性组。外周血白细胞数<25×109/L的患儿,初诊时外周血幼稚细胞百分比显著低于≥25×109/L组,血小板计数显著高于≥25×109/L组。结论:初诊时e2a-pbx1表达水平可以提示患儿初诊时的肿瘤负荷。MRD阳性患儿初诊时e2a-pbx1表达水平高,年龄小。初诊肿瘤负荷高的患儿,外周血血小板数低。

羊口疮病毒B2L、F1L基因融合真核表达质粒诱导小鼠的免疫应答及IL-2对其作用影响的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)B2L、F1L基因融合真核表达质粒pVAX1-B2L-F1L免疫小鼠诱导的体液和细胞免疫应答及IL-2对其免疫作用的影响。本研究将构建的pVAX1-B2L-F1L真核质粒转染MDBK细胞后,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测B2L-F1L融合基因在MDBK细胞中的表达;将pVAX1-B2L-F1L、pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2、pVAX1空载体、生理盐水对照组KM系小鼠通过后腿肌肉注射的方式免疫,采用ELISA方法检测免疫小鼠血清中OrfV特异性抗体以及Th1型(IL-2、IFN-γ)、Th2型(IL-4、IL-6)细胞因子;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,pVAX1-B2L-F1L重组质粒能够在MDBK细胞中表达;pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2联合免疫组小鼠血清抗体及IL-2和IFN-γ水平均显著高于pVAX1-B2L-F1L组;该联合免疫组小鼠血清IL-4、IL-6细胞因子水平与pVAX1-B2L-F1L组相比差异不显著(p>0.05);该联合免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平高于pVAX1-B2L-F1L组(p<0.05)。由此表明,pVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生OrfV特异性体液免疫和细胞免疫应答,联合pVAX1-IL-2诱导的免疫反应以细胞免疫应答为主,且能够促进Th1型细胞因子的分泌。本研究为OrfV基因工程疫苗的研制提供了参考依据。

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因的克隆与表达

目的 构建融合基因pcDNA3 1/His B IL 2 G1,为进一步研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗奠定基础。方法采用PCR从含有人源IL 2的质粒中扩增出IL 2片段 ,将人源IL 2插入真核表达载体pcDNA3 1/His B中 ,构建的质粒命名为pcDNA3 1/His B IL 2。同样采用PCR扩增汉坦病毒H82 0 5株G1基因片段 ,将回收的G1片段经双酶切插入到pcD NA3 1/His B IL 2 ,构建成新的质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1。采用脂质体介导包裹 ,转入NIH3T3细胞中进行瞬时表达 ;采用原位杂交观察细胞内的基因表达 ,SDS PAGE法作重组质粒pcDNA3 1/His B IL 2 G1瞬时表达产物的鉴定。结果 融合基因可转录并表达一分子量为 78kD左右的蛋白 ,对照组则未见电泳条带出现。结论 成功构建pcDNA3 1/His B IL 2 G1融合基因 。

EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建

目的：将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用，协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞。实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体，并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法：实验于2006—08／2007—08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行。应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3的DNA序列进行连接．构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A，脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果：限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体，筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆，收获病毒的滴度为7．8×10^6CFU／L，且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录。结论：携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒，进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A。

E2A-PBX1融合基因阳性的儿童急性淋巴细胞白血病携带变异型融合转录本

为了研究儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中E2A-PBX1融合基因的表达,采用位于E2A基因不同位置的上游引物与下游PBX1引物,检测了410例儿童ALL,包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL。结果发现:17例患儿携带E2A-PBX1融合基因,检出率4.1%,且全部为B细胞ALL,而且所有阳性病例均表达一种变异型融合转录本,后者是由E2A基因的第13外显子(159bp)被差异剪切形成的。经BLASTn比对分析,这种转录本保持了原来的开放阅读框,但导致53个氨基酸残基的丢失。这53个氨基酸残基位于活化区2,会导致融合蛋白中部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。结论:携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本,后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的,它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。

2A肽介导的割手密ScNAC1、ScDREB融合基因表达载体构建

【目的】本研究旨在构建适合甘蔗遗传转化的双基因表达载体,用于提高甘蔗栽培品种的抗旱能力,并探讨基因表达规律及互作效应。【方法】本研究以前期课题组在割手密中克隆到的具有抗旱功能ScNAC1和ScDREB为目的基因,以对单子叶植物高效、专一的Ubiquitin为启动子,以适于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAMBIA1300-nu为基础载体,利用改造后的FMDV2A多肽进行连接,采用重叠延伸PCR(简称SOE PCR)将ScNAC1和ScDREB基因相融合,利用同源重组的方法连接表达载体。【结果】经PCR验证获得约2000 bp的目的条带,利用BamH I与Sac I双酶切,切出了载体的1条大片段和连接目的基因的3条小片段,测序结果验证扩增产物的正确性,融合基因在扩增过程中无突变发生。【结论】本研究成功构建了符合需要的融合基因表达载体,为后期甘蔗的遗传转化研究奠定了基础。

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因BCL-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A/E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleaved caspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞BCL-2 mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明:AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleaved caspase-3蛋白的表达;转染了AML1-ETO的U937细胞系和具有AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论:BCL-2是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。

外周血幼稚淋巴细胞、染色体、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL融合基因联合检测用于儿童淋巴细胞白血病的早期诊断

目的探讨外周血幼稚淋巴细胞、染色体、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL融合基因联合检测用于儿童淋巴细胞白血病早期诊断的临床意义。方法对我院2012年8月至2017年6月门诊及住院儿童外周血涂片初查异常淋巴细胞的病例进行外周血幼稚淋巴细胞形态学检查,对其中高度怀疑急性淋巴细胞白血病的部分患者抽取静脉血检查染色体及TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL融合基因。结果 220例病例中有24例外周血涂片可见特殊类型的"白血病型"幼稚淋巴细胞,这种细胞在外周血细胞中比例范围在1%~38%,其中,比例范围在1%~10%的患者有3例,比例范围在11%~20%的患者有11例,比例范围在21%~38%的患者有10例,这24例患者后经骨髓检查验证除比例在1%~10%有2例为非白血病外,其余22例均为急性淋巴细胞白血病。我们对比例在11%~38%的21例患者抽取静脉血检查染色体及TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL融合基因,结果显示有2例染色体核型异常、5例TEL/AML1阳性,2例E2A/PBX1阳性、1例MLL阳性。结论外周血幼稚淋巴细胞、染色体、E2A/PBX1、TEL/AML1、MLL融合基因联合检测对儿童淋巴细胞白血病的早期诊断及提示性诊断有一定的临床意义,这种无创的检查模式相比经典有创的骨髓检查来说值得临床推广借鉴。

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coliM15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。

Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的研究进展

2004年WHO泌尿及男性生殖系统肿瘤分类将Xpl1．2易位／TFE3基因融合相关性肾癌正式列为独立的肾癌亚型，该肿瘤好发于儿童及青少年，女性多于男性，偶见于中老年人。国外研究旧0报道，其总体发病率虽然很低，但在儿童肾癌患者中约1／3为Xpl1．2易位性肾癌。其主要特点是基因组存在Xpl1．2位点的易位，形成新的融合基因，使转录因子TFE3表达量显著上升。

重组人干扰素α2a和GFE-1多肽融合基因的克隆、表达及活性测定

目的:构建IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因表达载体,获得高质量生物产品。方法:应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)α2a3'端酶切位点进行改造,人工合成编码能特异性高效结合肺组织的GFE-1寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM3Zf质粒,进行序列分析,将融合蛋白基因克隆入pBV220表达载体,在大肠杆菌中表达,对IFN-α2a-GFE-1表达产物纯化、鉴定及体外活性检测。结果:利用PCR的方法成功地改造了IFN-α2a3'端酶切位点,成功的将GFE-1多肽与IFN-α2a3'端连接,构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白的基因克隆载体pGEM3Zf-GFE-1,DNA测序完全正确。构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因原核表达载体pBV220-IFN-α2a-GFE-1,经温度诱导在大肠杆菌中有效表达。纯化了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大95%,比活性达5.8×109U/mg。结论:IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因的成功克隆、表达、纯化和活性测定,为研制一种具有导向性治疗肺癌、肺纤维化等疾病的有效药品奠定基础。

人干扰素α2b-胸腺肽α1融合基因在家蚕细胞中的表达和活性研究

根据细胞因子协同作用的特点,采用重组DNA技术构建了人干扰素(IFN)α2b 胸腺肽(THY)α1融合基因,克隆到pBacPAK8上,获得重组转移载体pBacPAK IFN THY.与线形化Bm BacPAK6病毒基因组DNA共转染家蚕细胞,经过体内重组,筛选到重组病毒Bm BacPAK IFN THY.将Bm BacPAK IFN THY感染家蚕细胞进行表达.DNA印迹证明IFN THY已插入Bm BacPAK6中(4kb左右的杂交带);SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质印迹证明IFN THY在家蚕细胞中得到了表达(分子质量为 2 3ku左右),且具有IFN蛋白的免疫原性;微量细胞病变抑制法和玫瑰花结法显示 96h的表达产物IFN活性为 3 72× 10 4U/ml,12 0h表达产物IFN活性为 3 10× 10 5U/ml,4 8～ 72h表达产物IFN活性较低;4 8～ 12 0h表达产物的玫瑰花结形成率均在 10 %以上.结果表明融合基因在家蚕细胞中得到了高效表达,表达的融合蛋白具有IFN α2b和THY

脑缺血大鼠脑组织中发动蛋白相关蛋白1和线粒体融合基因2的动态表达

目的:探讨脑缺血后线粒体分裂蛋白及融合蛋白表达水平的变化。方法:72只大鼠随机分为脑缺血后组及假手术组,每组18只。采用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线栓塞大脑中动脉建立脑缺血模型。应用苏木精-伊红染色(HE染色)观察大脑皮质神经元形态结构,蛋白免疫印迹法检测脑组织Drp1及Mfn2的蛋白含量,rt-PCR检测Drp1及Mfn2的mRNA基因的表达情况。结果:脑缺血组的Drp1蛋白及其mRNA基因的表达明显高于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐增加(P<0.01);脑缺血组Mfn2蛋白及其表达mRNA基因的表达低于假手术组,且随着时间的延长表达逐渐减少(P<0.01)。结论:线粒体分裂和融合蛋白表达异常可能是脑缺血后脑组织损伤的重要机制。