有氧运动抑制炎症反应改善ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠心肌纤维化机制研究

背景动脉粥样硬化(AS)会引发心肌梗死、心肌纤维化等心血管病变,随着全球人口老龄化加重,发病人群逐渐增多。炎症反应是心肌纤维化的关键因素,规律的有氧运动可以减轻炎症保护心肌功能。但有氧运动对AS心肌纤维化的保护机制尚不清楚。目的本研究旨在探讨有氧运动对AS小鼠心肌纤维化的影响机制。方法2022年2—8月选取27只8周龄的雄性ApoE^(-/-)小鼠作为实验对象,将小鼠随机分为对照组、模型组和有氧运动组,每组9只。制备AS小鼠模型,对小鼠进行运动训练,Masson染色、苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织情况,蛋白质印迹法(Western blotting)检测心肌组织NOD受体3(NLRP3)、白介素1β(IL-1β)、转化生长因子β1(TGF-β1)蛋白表达情况,检测超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达量。结果Masson染色结果示模型组心肌组织纤维化较对照组明显加重;有氧运动组心肌组织纤维化较模型组明显改善。HE染色结果示模型组小鼠心肌细胞排列较错乱,细胞形态、大小异常,细胞间隙增大,存在炎性细胞浸润;有氧运动组小鼠心肌细胞排列尚整齐,细胞形态、大小异常,细胞间隙基本正常。模型组NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达高于对照组,有氧运动组NLRP3、IL-1β、TGF-β1蛋白表达低于模型组、高于对照组(P<0.05)。模型组SOD、GSH-Px表达量低于对照组,有氧运动组SOD、GSH-Px表达量高于模型组、低于对照组(P<0.05)。结论有氧运动明显改善ApoE^(-/-)AS小鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制心肌炎性反应、激活抗氧化水平有关。

基于PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路探讨芪黄疽愈方对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成的影响及其作用机制

目的 基于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ/肝X受体(LXR)α/三磷酸腺甘结合盒转运体(ABC)A1信号通路探讨芪黄疽愈方影响对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)形成及其作用机制。方法 选取25只C57BL/6小鼠作为空白组给予普通饲料喂饲配合生理盐水灌胃,68只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组(24只)、中药组(22只)、对照组(22只)给予高脂饲料喂饲配合对应药物灌胃,12 w后通过主动脉苏木素-伊红(HE)染色证实造模成功,通过小鼠状态了解小鼠一般状况;主动脉HE染色、油红O染色观察动脉硬化及脂质沉积情况;肝脏HE染色、油红O染色观察肝脏病理变化、红染脂滴情况,并通过Western印迹、聚合酶链反应(PCR)检测PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达情况。结果 空白组皮毛水润光泽,精神状态良好,活跃,饮食饮水正常;模型组精神萎靡,皮毛晦暗,倦怠懒动,饮食差,饮水正常;与模型组相比,中药组及对照组给药后各症状均有不同程度改善。各组主动脉HE、油红O染色显示,空白组主动脉切片未见AS斑块,主动脉大体标本未见明显红染脂质;与空白组相比,模型组主动脉切片可见斑块,大体标本可见明显红染脂质;与模型组相比,中药组及对照组动脉切片中AS斑块面积较小,大体标本中红染脂质面积较小。小鼠肝脏HE、油红O染色显示,空白组肝细胞结构正常,细胞核位于细胞中央,细胞沿中央静脉为中心向四周放射排列,未见脂肪变性;油红O未见红染脂质;与空白组比较,模型组肝细胞排列紊乱,胞内可见形态不同、大小不等、数量不一的脂滴空泡,油红O切片可见大量红染脂质。与模型组比较,对照组、中药组肝脏病变程度减轻,肝细胞结构大部分清晰可见,脂滴数量减少,油红O红染脂质明显减少。Western印迹检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白的表达;与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组均显著升高(P<0.05)。PCR检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA的表达,与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组显著升高(P<0.05)。结论 芪黄疽愈方能够影响小鼠动脉硬化,升高肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达,调节肝脏脂质代谢,促进胆固醇逆转运,延缓AS进展。

载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠整装(whole-mount)主动脉免疫荧光组织化学染色的血管外膜淋巴管成像

目的 探索载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠整装(whole-mount)主动脉免疫荧光组织化学染色法显示血管外膜淋巴管的可行性。方法 制备ApoE^(-/-)小鼠整装主动脉,进行淋巴管内皮受体1(LYVE1)、 α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光组织化学染色,染色后组织经5 g/L苏丹黑B处理30 min、组织透明液透明,移至自制的样本容器中,荧光显微镜下成像。结果经5 g/L苏丹黑B处理的整装主动脉可见血管自发荧光显著降低,外膜淋巴管的特异性荧光强度显著增强,更易观察且不会对其他通道荧光产生干扰。结论 建立的ApoE^(-/-)小鼠整装主动脉免疫荧光组织化学染色显示血管外膜淋巴管的方法操作简便,特异性好。

香菇多糖对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成及AMPK信号通路的影响

目的:探讨香菇多糖(LNT)对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)斑块形成及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法:ApoE^(-/-)小鼠分为模型组、立普妥组(5 mg/kg)、LNT低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)剂量组,以相似遗传背景的C57BL/6小鼠为对照组。灌胃给药12周后,全自动生化分析仪检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平;ELISA检测血清IL-6、IL-1β水平;油红O染色观察整体主动脉斑块形成情况;HE染色观察主动脉根部斑块形成情况;蛋白免疫印迹检测主动脉AMPK通路蛋白表达。结果:与对照组比较,模型组血清TC、TG、LDL-C、IL-6、IL-1β水平、主动脉斑块面积、主动脉根部斑块面积、主动脉组织NLRP3、IL-6、IL-1β表达显著升高,主动脉组织p-AMPK/AMPK表达和血清HDL-C水平降低(P<0.05);与模型组比较,立普妥组、LNT中、高剂量组TC、TG、LDL-C、IL-6、IL-1β、主动脉斑块面积、主动脉根部斑块面积、主动脉组织NLRP3、IL-6、IL-1β表达显著降低,主动脉组织p-AMPK/AMPK表达和血清HDL-C水平显著升高,且LNT各剂量组间差异有统计学意义(P<0.05);立普妥组与LNT高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:LNT可能通过激活AMPK通路抑制AS小鼠炎症反应和AS斑块形成。

健脾祛痰方对限制活动ApoE^(-/-)小鼠体成分/行为学变化的影响

目的:观察健脾祛痰方对限制活动载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E Knockout,ApoE^(-/-))小鼠体成分/行为学变化的影响。方法:将30只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组,阿托伐他汀组以及健脾祛痰方低浓度组、健脾祛痰方中浓度组、健脾祛痰方高浓度组;将6只C57BL/6J小鼠作为正常组。正常组以普通饲料喂养,其余5组以高脂饲料喂养,阿托伐他汀组进行阿托伐他汀2.4 mg/(kg·d)灌胃,健脾祛痰方低浓度组、健脾祛痰方中浓度组、健脾祛痰方高浓度组以健脾祛痰方[2.97 g/(kg·d)、5.94 g/(kg·d)、11.88 g/(kg·d)]灌胃,正常组和模型组以等体积生理盐水灌胃,12周后进行脾虚痰浊模型评价。实验期间每周观察小鼠的皮毛色泽、活动能力及大便性状,检测体成分,以旷场实验、跑台实验进行动物行为学评估。结果:与正常组比较,模型组小鼠旷场实验运动总距离减少,跑台实验跑步力竭时间降低,体脂降低,差异有统计学意义(P <0.01)。与模型组比较,健脾祛痰方低浓度组、健脾祛痰方中浓度组、健脾祛痰方高浓度组小鼠旷场实验运动总距离呈上升趋势,但差异无统计学意义(P> 0.05);健脾祛痰方中、高浓度组小鼠跑台实验跑步时间增加,差异有统计学意义(P <0.05,P <0.01);阿托伐他汀组和健脾祛痰方低浓度组跑步时间均呈上升趋势,但差异无统计学意义(P> 0.05);健脾祛痰方低浓度组、健脾祛痰方中浓度组、健脾祛痰方高浓度组小鼠体脂呈上升趋势,但差异无统计学意义(P> 0.05);阿托伐他汀组小鼠体脂显著增加,差异有统计学意义(P <0.01)。结论:健脾祛痰方可增加限制活动ApoE^(-/-)小鼠的行为活动,但对体成分改善作用不显著。

黄连解毒汤与降脂药对ApoE^(-/-)小鼠固有免疫反应影响的比较研究

目的比较黄连解毒汤及降脂药阿托伐他汀、非诺贝特和罗格列酮对高脂饮食饲喂载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠全身固有免疫反应及主动脉局部免疫反应的影响。方法采用配对比较法将60只雌性8周龄ApoE^(-/-)小鼠分为对照、模型、阿托伐他汀、非诺贝特、罗格列酮和黄连解毒汤6组,每组10只,10只匹配的C57BL/6J小鼠为野生对照组。对照组与野生对照组小鼠给予普通饲料,模型组小鼠给予高脂饲料,给药组小鼠造模同时分别给予阿托伐他汀(3 mg/kg)、非诺贝特(33 mg/kg)、罗格列酮(0.67 mg/kg)、黄连解毒汤水煎液(5 g/kg)灌胃。4周后,每组取5只小鼠,生化检测血浆血脂水平,流式细胞仪检测外周血单核细胞比例及表面Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)和清道夫受体CD36的表达、单核细胞亚型比例,HE染色检测主动脉组织病理变化,RT-qPCR检测主动脉组织炎性细胞因子表达;余下小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),流式微球阵列(cytometric bead array,CBA)和ELISA检测血浆细胞因子的水平。结果与野生对照组比较,对照组小鼠血浆总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平明显升高(P<0.01),高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)水平明显降低(P<0.01);外周血单核细胞炎症亚型Ly6C++比例升高(P<0.05),Ly6C-和Ly6C+比例降低(P<0.05);主动脉组织炎性因子白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-12、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein,MCP)-1和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)-2表达升高(P<0.05);LPS刺激后,对照组小鼠血浆IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠TC、TG、HDL和LDL水平进一步升高(P<0.05);外周血单核细胞的比例增多(P<0.05),CD36的表达增加(P<0.05);主动脉组织炎性因子IL-1β、IL-12、TNF-α和NOS-2表达升高(P<0.05);LPS刺激后,血浆IL-1β、IL-12 p70和MCP-1水平升高(P<0.05)。与模型组比较,阿托伐他汀干预没有改善血脂水平(P<0.05),但降低主动脉组织炎性因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、MCP-1和NOS-2 mRNA表达(P<0.05)。非诺贝特干预降低HDL水平(P<0.01);LPS刺激后,降低主动脉组织IL-12、TNF-α、MCP-1和NOS-2 mRNA表达(P<0.05)。罗格列酮干预没有改善血脂水平(P>0.05),但降低外周血单核细胞及其炎症亚型Ly6C^(++)比例(P<0.05),降低主动脉组织IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α和NOS-2 mRNA表达(P<0.05);LPS刺激后,罗格列酮降低血浆IL-12 p70的水平(P<0.05)。黄连解毒汤干预并未改善血脂水平,但显著降低外周血单核细胞及其炎症亚型Ly6C^(++)比例以及TLR4和CD36在单核细胞的表达水平(P<0.05),降低主动脉组织IL-1β、IL-12和NOS-2 mRNA表达(P<0.05)。结论黄连解毒汤、阿托伐他汀、非诺贝特和罗格列酮减轻高脂血症引发的固有免疫反应,且其免疫调节作用不依赖于降脂作用。其中黄连解毒汤和罗格列酮对全身固有免疫的调控作用优于阿托伐他汀和非诺贝特。

Ⅰ型毛-肝-肠综合征小鼠模型构建及表型分析

目的 建立基于Ttc37(Tetratricopeptide Repeat Domain 37)基因缺失的Ⅰ型毛-肝-肠综合征(trichohepato-enteric syndrome,THES)的小鼠疾病模型。方法 利用CRISPR/CAS9技术在小鼠Ttc37基因中插入loxP序列构建Ttc37flox品系,通过与全身表达的CAG-Cre品系交配产生全身敲除小鼠Ⅰ型THES动物模型(Ttc37flox/flox;CAG-Cre),利用荧光定量PCR和Western blot确认敲除效果。选取8周龄小鼠,对皮肤、脾脏、肝脏、膀胱和胃肠道等主要组织进行苏木精-依红染色和病理分析,对血清中的谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)进行酶学检测,对血清中的血红蛋白进行检测,注射抗原后利用ELISA检测免疫球蛋白IgM和IgG水平。结果 Ttc37flox/flox;CAG-Cre表现出与Ⅰ型THES相似的毛发、皮肤、B细胞和眼睛发育异常表型;常规饲养条件下未表现出肝脏、胃肠道、膀胱和血红蛋白异常。结论 Ⅰ型THES的小鼠疾病模型构建成功,可用于病理机制研究。

西方饮食饲料对APOE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化造模的影响

目的为了研究西方饮食饲料快速建模及对APOE^(-/-)小鼠生物学指标及组织病理学的影响。方法用48♀48♂APOE^(-/-)小鼠、48♀48C57BL/6J进行了试验,分为8组,分别为APOE^(-/-)普通繁殖料组(24♀24♂)和APOE^(-/-)西方饮食饲料组(24♀24♂)、C57BL/6J普通繁殖料组(24♀24♂)和C57BL/6J西方饮食饲料组(24♀24♂)。从3周开始饲喂,直到20周实验结束。实验结束后采集血清检测生化指标,分离主动脉做大体油红O染色及分析,主动脉根部做石蜡切片和HE染色。结果西方饮食没有显著增加APOE^(-/-)体重,但可以显著提高APOE^(-/-)鼠的血脂指标、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,促进动脉粥样硬化斑块的形成,雄鼠适合主动脉大体斑块的造模,雌鼠适合主动脉弓根部斑块造模。结论西方饮食饲料可以促进APOE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化造模,增加主动脉斑块面积比,缩短建模时间,提高建模的均一性。

IgM亚类抗体3A6抑制ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成

目的探究天然属性抗氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)IgM亚类抗体3A6对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法以ApoE^(-/-)小鼠为研究对象,将小鼠(18只)随机分为3组,即对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液)、5G8组(腹腔注射天然属性抗LDL的IgM亚类抗体)和3A6组(腹腔注射天然属性的抗ox-LDL的IgM亚类抗体),每组各6只。高脂高胆固醇饮食饲喂12周,观察各组小鼠体质量,检测小鼠血脂的水平;苏木精-伊红染色分析小鼠主动脉的病理变化及斑块面积。结果3组小鼠的体质量、血脂水平和ox-LDL水平比较,差异无统计学意义(P=0.087);与对照组比较,3A6组小鼠动脉粥样硬化斑块面积显著减少,差异有统计学意义(P=0.023)。结论天然IgM亚类抗体3A6能够抑制ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。

心脉康增强血管平滑肌细胞自噬改善ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化

目的探讨心脉康(鳖甲、三棱、莪术等组成)调节血管平滑肌细胞(VSMC)自噬改善动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法72只敲除载脂蛋白E基因(ApoE^(-/-))的小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物(阿托伐他汀钙片)对照组(2.6 mg·kg^(-1))及心脉康低、中、高(30、60、90 g·kg^(-1))剂量组,每组12只。空白组小鼠喂养常规饮食,余下各组喂养高脂饮食12周,建立AS模型。模型复制成功后给予心脉康灌胃6周,每天1次。检测小鼠血清血脂四项:总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C);油红O、HE和Masson染色观察小鼠主动脉根部血管组织病理变化;免疫荧光检测主动脉根部血管组织微管相关蛋白l轻链3B(LC3B)和平滑肌22 alpha蛋白(SM22α)的表达;采用Western Blot法检测主动脉血管组织中LC3B、自噬效应蛋白1(Beclin-1)和SM22α蛋白的表达水平;qRT-PCR法检测主动脉中LC3B、Beclin-1和SM22αmRNA的表达。结果与空白组比较,模型组小鼠血清血脂四项结果显示,HDL-C下降,TC、TG、LDL-C均升高(P<0.05);油红O、HE和Masson染色结果显示,小鼠主动脉根部血管组织斑块面积增多,内壁增厚并伴有大量胆固醇结晶以及炎症细胞浸润,胶原纤维含量减少;免疫荧光结果显示,LC3B和SM22α共定位面积明显减少(P<0.05);qRT-PCR和Western Blot结果显示,LC3B,Beclin-1和SM22α蛋白及m RNA表达下降(P<0.05)。与模型组比较,心脉康低、中、高剂量组及阳性药物对照组HDL-C水平明显升高,TC、TG、LDL-C水平明显降低(P<0.05);主动脉内斑块面积减少,胆固醇结晶以及炎症浸润降低,胶原纤维含量增多;LC3B和SM22α共定位面积明显增加(P<0.05);LC3B、Beclin-1、SM22α蛋白以及mRNA表达增加(P<0.05)。结论心脉康能降低血脂水平,减少斑块面积,改善动脉粥样硬化,其机制可能与增强血管平滑肌细胞自噬水平有关。

芳香新塔花总黄酮通过调控PPARγ/LXRα/ABCA1通路对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质代谢紊乱的影响

目的探究芳香新塔花总黄酮对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质代谢及对PPARγ/LXRα/ABCA1通路的影响。方法60只ApoE^(-/-)小鼠给予高脂饲料喂养8周后随机分为模型组、阿托伐他汀组(3 mg/kg)及芳香新塔花总黄酮低、中、高剂量组(25、50、100 mg/kg),每组12只。灌胃给予相应剂量药物干预12周,给药同时继续饲喂高脂饲料;另取12只C57BL/6J小鼠为空白组,灌胃给予生理盐水,同时喂养普通饲料。给药结束后,油红O染色观察肝组织脂质沉积情况,HE染色观察主动脉斑块形态,全自动生化分析仪检测血脂水平,ELISA法检测血清IL-18、IL-1β、MCP-1水平,试剂盒检测肝组织TC、TG、NEFA、FC水平,Western blot法检测肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1蛋白表达。结果与空白组比较,模型组肝脏脂滴面积增加(P<0.01),血清TC、TG、LDL-C、IL-18、IL-1β、MCP-1水平和肝组织TC、TG、NEFA、FC水平均升高(P<0.05,P<0.01),血清HDL-C水平和肝组织PPARγ、LXRα、ABCA1、ABCG1蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,阿托伐他汀组和总黄酮中、高剂量组上述指标均有改善(P<0.05,P<0.01)。结论芳香新塔花总黄酮可抑制ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠肝脏脂质代谢水平,其机制可能与激活PPARγ/LXRα/ABCA1通路有关。

RAD51C表达下调对小鼠卵巢癌体内成瘤和VEGF、NRP-2表达的调控

目的探讨RAD51旁系同源基因C(RAD51C)表达下调对小鼠卵巢癌体内成瘤和血管内皮生长因子(VEGF)、神经纤毛蛋白-2(NRP-2)表达调控的影响。方法使用A2780卵巢癌细胞,通过培养检测细胞中RAD51C的表达,构建3种RAD51C干扰载体(SiRNA-47、SiRNA-183和SiRNA-285),并包装成慢病毒,转染细胞,逆转录实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证转染效果,进行稳筛,构建稳转细胞株。使用Balb/c雌性裸鼠建立细胞系来源的异体移植肿瘤模型(CDX)模型,将18只建模成功的裸鼠分为3组:A2780细胞组(Control组)、A2780细胞+空载体对照组(NC组)、A2780细胞+RAD51C干扰组(Si-RAD51C组),每组各6只。Control组注射生理盐水,NC组注射空载慢病毒50μL,Si-RAD51C组注射RAD51C干扰慢病毒50μL。观察各组成瘤情况,取肿瘤组织,采用蛋白质印迹法(WB)、免疫组织化学检测RAD51C、VEGF、NRP-2蛋白表达情况。结果RT-qPCR验证RAD51C干扰慢病毒转染效果以SiRAN-285最明显(P<0.05)。Si-RAD51C组与Control组、NC组比较瘤体的体积最小、重量也最轻,且RAD51C、NRP-2及VEGF蛋白的表达显著降低(P<0.05)。结论RAD51C干扰慢病毒可抑制小鼠A2780卵巢癌细胞肿瘤的形成,且对RAD51C、NRP-2及VEGF蛋白的表达均有抑制作用。

化瘀祛痰方对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化小鼠肠道菌群及肠黏膜屏障损伤的影响

目的观察化瘀祛痰方对ApoE^(-/-)动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)小鼠肠道菌群及黏膜屏障的影响,探讨调控肠道菌群及肠黏膜屏障防治AS的作用机制。方法40只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组,化瘀祛痰方低、中、高剂量组,10只C57BL/6J小鼠作为正常组。模型组及各治疗组均给予高脂饲料喂养,正常组给予普通饲料喂养。造模成功后化瘀祛痰方不同剂量组分别给予相应的药物灌胃,对照组与模型组给予等量的生理盐水。30 d后16S rDNA分析小鼠肠道菌群变化;HE染色观察肠黏膜屏障病理变化;ELISA法检测血清及肠道内容物中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的含量;Western blot法及Realtime RT-PCR法检测肠道上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin1蛋白及mRNA表达。结果与正常组相比,模型组肠道菌群多样性降低,厚壁菌门及放线菌门比例升高,拟杆菌门及变形菌门的比例降低;毛螺菌属(f-Lachnospiraceae)、梭菌目(o-Clastridiales)、梭菌属(c-Clastridia)、脱硫弧菌科(f-Desulfovibrionaceae)、脱硫弧菌目(o-Desulfovibrionales)丰度存在差异。模型组小鼠HE染色显示,肠上皮细胞上皮下间隙增宽,大片绒毛脱落,固有层裸露;血清及盲肠内容物LPS水平升高(P<0.05或P<0.01);肠道上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1、Occludin蛋白及mRNA的表达降低(P<0.05或P<0.01)。化瘀祛痰方干预后,肠上皮细胞上皮下间隙变窄,绒毛脱落减少;血清及盲肠内容物LPS水平显著降低(P<0.05或P<0.01);ZO-1、Claudin1、Occludin蛋白及mRNA的表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论化瘀祛痰方可能通过调节ApoE^(-/-)小鼠肠道菌群结构,改善肠道黏膜屏障功能,降低炎性介质LPS释放入血,从而防治动脉粥样硬化。

Piezo1在不同周龄ApoE^(-/-)小鼠中的表达水平及对血管内皮功能的作用

目的:探明ApoE^(-/-)小鼠中机械敏感性离子通道Piezo1的表达变化及Piezo1在动脉粥样硬化血管内皮功能中的作用。方法:选用24只SPF级8周龄雄性ApoE^(-/-)小鼠为模型组,24只SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠为正常对照组,高脂饲料喂饲,于高脂饲料干预的第12、14、16和18周,每组各处死6只小鼠,检测小鼠主动脉病理情况、血脂水平、血管内皮功能及Piezo1的表达。进一步选用SPF级8周龄Piezo1^(flox/flox)Cdh5-Cre^(+)/ApoE^(-/-)(以下简称Cre^(+))小鼠与Piezo1^(flox/flox)Cdh5-Cre-/ApoE^(-/-)(以下简称Cre-)小鼠各10只,采用高脂饲料喂养12周,从小鼠病理染色、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、内皮素1(endothelin-1,ET-1)、前列环素I_(2)(prostaglandin I_(2),PGI_(2))、血栓素A_(2)(thromboxane A_(2),TXA_(2))和离体血管环张力等多方面检测Piezo1缺失对动脉粥样硬化小鼠血管内皮功能的影响。结果:通过对高脂饲料喂养不同时间的小鼠进行观察显示,模型组小鼠主动脉斑块较正常组逐渐加重;血脂水平较正常组显著升高(P<0.01)。血清中eNOS与PGI_(2)的含量降低(P<0.01),ET-1与TXA_(2)含量增多(P<0.05)。免疫荧光染色显示模型组小鼠主动脉斑块组织中内皮细胞完整性受损,Piezo1的表达较正常组升高,但随着高脂饲料喂养周时的延长,模型组小鼠Piezo1的荧光强度及m RNA水平逐渐下降。通过Person相关性检验分析显示,Piezo1与小鼠内皮功能相关指标eNOS和PGI_(2)表达呈正相关,与ET-1和TXA_(2)表达呈负相关(P<0.01)。Piezo1表达水平与血管内皮功能有较强相关性。进一步在基因敲除小鼠中观察到,Cre^(+)小鼠主动脉斑块面积较Cre-小鼠显著降低(P<0.01);Cre^(+)小鼠血清eNOS和PGI_(2)含量较Cre-小鼠显著减少(P<0.05,P<0.01),TXA_(2)含量较Cre-小鼠显著增加(P<0.05)。血管细胞活力检测观察到Cre^(+)小鼠细胞活力较Cre-小鼠显著减弱(P<0.01)。小鼠离体主动脉张力检测显示Cre^(+)小鼠主动脉环对乙酰胆碱的内皮依赖性舒张作用较Cre-小鼠显著减弱(P<0.05)。免疫荧光染色检测到Cre^(+)小鼠主动脉斑块组织中内皮细胞完整性受损较Cre-小鼠严重,Piezo1的表达降低。结论:Piezo1参与了ApoE^(-/-)小鼠的病理进程,与血管内皮功能密切相关,Piezo1基因的缺失影响了ApoE^(-/-)小鼠斑块的形成,加重血管内皮功能的损伤。

基于TLR_(4)/MyD88/NF-κB通路探讨茯砖茶改善ApoE^(-/-)小鼠非酒精性脂肪肝的作用

目的研究茯砖茶对载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))小鼠肝组织TLR_(4)/MyD88/NF-κB通路的影响,探讨其抑制非酒精性脂肪肝(NAFLD)形成的作用机理。方法将50只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组和茯砖茶高、中、低剂量组(216、144、072 g/kg),每组10只,高脂饲料连续喂养17周并同时予以相应药物灌胃干预;另取8周龄C57BL/6J野生小鼠作为空白组,普通饲料喂养17周并予以生理盐水灌胃干预。给药结束后,取肝脏行HE染色观察组织病理变化,采用RT-qPCR法检测小鼠肝组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子Kappa B(NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-β)、脂肪酸合成酶(FAS)mRNA表达。结果模型组小鼠肉眼可见肝脏体积增大,边缘变钝,呈黄色油腻感,镜下可见大小不等的脂肪空泡形成,证实模型制备成功;茯砖茶高、中剂量组小鼠脂肪变性程度轻于模型组,茯砖茶各剂量组小鼠肝组织TLR4、MyD88、NF-κB、IL-β、FAS mRNA表达低于模型组(P<005)。结论茯砖茶可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路来达到预防NAFLD形成的作用。

注射用蜂毒对热痛模型小鼠的痛阈和外周血P物质、β-内啡肽水平的影响

目的:探索注射用蜂毒(BVI)对热痛模型小鼠的镇痛作用及对外周血P物质(SP)、β-内啡肽(β-EP)水平的影响。方法:选择合格昆明小鼠200只,随机分为BVI大剂量(BVI-H)组、BVI中剂量(BVI-M)组、BVI小剂量(BVI-L)组、吗啡组、模型对照组,给药后分别采用热板法和辐射热法建立小鼠热痛模型,观察不同组别给药后不同时间痛阈的动态变化;实验结束后,心脏取血,分离血清,ELISA法检测血清SP、β-EP水平。结果:BVI各剂量组和吗啡组均显示出明显的镇痛作用,BVI在热板法疼痛模型的作用具有剂量依赖性。BVI对小鼠疼痛模型血清SP、β-EP水平有一定影响,BVI各剂量组和吗啡组均对SP显示出下调效应;血清β-EP水平在BVI-L组升高,BVI-M组和BVI-H组则下降。结论:BVI对小鼠热痛模型具有显著镇痛作用,其相关机制可能与抑制内源性疼痛介质传递、增加内源性镇痛介质分泌等有关。

六味地黄方通过调节肠道菌群和胆汁酸代谢改善绝经后APOE^(-/-)小鼠的胆固醇代谢异常

目的探究六味地黄方调节肠道菌群和胆汁酸代谢改善小鼠绝经后胆固醇代谢异常及可能的作用机制。方法利用双侧卵巢摘除的APOE^(-/-)小鼠给予高脂饮食,复制绝经后胆固醇代谢异常模型,并给予0.13 mg·kg^(-1)的雌二醇和9.0 g·kg^(-1)的六味地黄方进行治疗。90 d治疗结束后,生化法检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)和肝脏、粪便中TC水平;ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)水平;肝脏HE和油红O染色观察小鼠肝脏脂质损伤;生化法检测小鼠肝脏、血清、胆囊和粪便中总胆汁酸(TBA)含量;液相质谱联用技术(UPLC-MS)对小鼠肝脏和粪便胆汁酸组分定量分析;16S rRNA测序分析小鼠结肠菌群,并分析粪便胆汁酸组分和肠道菌群之间的相关性。结果六味地黄方可以降低模型小鼠血清TC、TG、LDL-c以及TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.01),提高HDL-c水平(P<0.01);并减少肝脏脂质堆积,减轻肝脏损伤;还可降低血清、胆囊和肝脏TBA水平(P<0.01),增加粪便中TBA排出(P<0.01);减少粪便TαMCA、TβMCA、TCA、TCDCA、TDCA和CA结合型胆汁酸的含量(P<0.05,P<0.01),增加次级胆汁酸LCA的含量(P<0.01)。六味地黄方恢复了模型小鼠结肠菌群的平衡,上调粪异杆菌属(Allobaculum)的相对丰度(P<0.01),并下调颤螺菌属(Oscillospira)和普氏菌(Prevotella)的相对丰度(P<0.05)。结论六味地黄方通过重塑结肠菌群的结构恢复菌群的平衡,增加粪便中次级胆汁酸的排出以降低血清和肝脏中胆固醇沉积,从而改善模型小鼠胆固醇代谢异常。

Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)小鼠肝脏原位异种重建模型的建立及其评价

目的:构建猪-小鼠肝细胞嵌合模型,探讨猪肝细胞在无T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)介导排斥条件下的移植及再生的相关条件,评估猪肝细胞在异种受体中的定居、增殖和功能因子分泌情况,为提高猪源化小鼠模型中猪肝细胞的重建效率提供依据。方法:采用脾脏内注射法将猪肝细胞移植至Fah^(-/-)Rag2^(-/-)IL2Rg^(-/-)(FRG)小鼠体内,构建移植模型。将16只FRG小鼠随机分为对照组、空白对照组、实验组和绿色荧光蛋白(GFP)基因实验组,每组4只。空白对照组小鼠停止给予2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,4-环己二酮(NTBC),监测体质量;对照组4只小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;实验组小鼠注射猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d;GFP基因实验组小鼠注射携带GFP基因猪肝细胞,移植前1周停止给予NTBC,移植后监测体质量,当体质量下降20%时,给予NTBC 3 d。观察各组小鼠体质量、生存情况。检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平,流式细胞术检测各组小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞表达情况,ELISA法检测各组小鼠血清中猪白蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠猪肝细胞再生效率。结果:与剪碎后再以胶原酶消化的方式比较,两步灌注法消化过程更温和、对细胞损伤更小,细胞活性可以达到92%。停止给予NTBC后,对照组小鼠体质量进行性降低,生命活力逐渐降低。连续停药第28天小鼠开始出现死亡现象。小鼠肝组织中出现肝细胞肿大、细胞浆疏松透亮和细胞核溶解等不可逆细胞损伤。空白对照组小鼠停药后血清中ALT水平逐渐升高。对照组停药小鼠重新给予NTBC后,体质量逐渐恢复至正常水平。流式细胞术,停止给予NTBC后,小鼠外周血中CD19+、CD3+和NK1.1+细胞完全缺失。免疫组织化学染色,实验组小鼠肝组织中未见深色Fah+阳性细胞,移植小鼠肝组织中可见深色Fah+阳性细胞,猪肝细胞再生效率为(11±4)%。GFP基因实验组小鼠可见同一视野经三色激光分别激发,猪肝细胞再生效率为(10±2)%。结论:成功构建了猪源化FRG小鼠肝脏嵌合模型,建立了长效稳定扩增猪肝细胞的小鼠模型。

丹参有效成份配伍对ApoE^(-/-)小鼠心脏的保护作用及TLR4/NF-κB通路的影响

目的研究丹参4种主要的水溶性成分丹参素(DSS)、丹酚酸(Sal)-A、Sal-B和原儿茶醛(PAL)的有效配伍组合(SABP)对ApoE基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠心脏的保护作用及其机制。方法6周龄雄性的ApoE^(-/-)小鼠被随机分为:模型(Model)组、SABP组、阳性药瑞舒伐他汀(RC)组。雄性的C57BL/6J小鼠作为正常对照(Control)组。所有的小鼠正常饮食。RC组每天腹腔注射0.4 mg/kg的RC,SABP组每天腹腔注射丹参4种水溶性成分的有效组合(DSS:5 mg/kg,Sal-A:0.233 mg/kg,Sal-B:10.000 mg/kg,PAL:17.000 mg/kg)。Control组和Model组每天腹腔注射等剂量的生理盐水。8 w后,通过全自动生化分析仪检测血清脂类水平,苏木素-伊红(HE)染色观察心脏的形态学变化。免疫组化和Western印迹检测心脏组织中Toll样受体(TLR)4、转化生长因子β激活激酶(TAK)1、核转录因子(NF)-κB、白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达的变化。结果SABP可以有效地降低血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,改善心脏损伤,减少心脏中TLR4、TAK1、IL-6和TNF-α蛋白表达,抑制NF-κB的磷酸化。结论SABP对ApoE^(-/-)小鼠心脏具有保护作用,其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路有关。

ApoE^(-/-);SAP-Tg小鼠模型的构建

目的为研究SAP蛋白在动脉粥样硬化中的作用及机制,拟构建ApoE-/-;SAP-Tg小鼠模型。方法分别选取6~8周龄的雄性ApoE-/-小鼠与血清淀粉样蛋白P转基因(SAP-Tg)6周龄的雌性小鼠杂交,得到的杂交后代以剪尾方式提取基因组DNA,用PCR法检测小鼠的基因型。结果雄性ApoE-/-小鼠与雌性SAP-Tg小鼠杂交得F1代后自交,在F2代获得ApoE-/-;SAP-Tg基因型小鼠,模型构建成功。结论将ApoE-/-小鼠与SAP-Tg小鼠杂交2代后成功建立了ApoE-/-;SAP-Tg小鼠模型,并可通过筛选出的F2代ApoE-/-小鼠和ApoE-/-;SAP-Tg小鼠交配进行繁育筛选工作。