锌转运体7基因沉默抑制APP转基因细胞APP表达和Aβ分泌

目的锌转运体7(ZnT7)在阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)患者脑内高表达并在老年斑内形成聚集效应。但其是否参与AD发病尚不清楚,本实验旨在探讨ZnT7基因沉默对APP转基因细胞APP/Aβ表达水平的影响。方法应用RNAi技术对APP转基因细胞进行ZnT7基因沉默,并采用RT-PCR,WesternBlot,免疫荧光,ELISA,MTT方法,分析ZnT7基因沉默对APP转基因细胞对APP蛋白的表达、Aβ分泌和细胞活力的影响。结果免疫荧光双标结果显示,ZnT7RNAi可明显抑制APP转基因细胞的ZnT7和APP表达;WesternBlot结果显示,ZnT7RNAi可明显抑制APP转基因细胞的APP蛋白表达;ELISA结果显示,ZnT7RNAi可明显抑制APP细胞转基因的Aβ分泌。结论 ZnT7可能参与细胞内APP代谢,ZnT7基因可作为AD治疗的一个潜在靶点。

还脑益聪方提取物含药血清对APP/PS1双基因转染细胞γ分泌酶活性及相关蛋白表达的影响

目的观察中药复方-还脑益聪方提取物(Huannao Yicong decoction,HYD)含药血清对β-淀粉样前蛋白swe基因(APPswe)人类早老素(PSEN1d E9,PS1)和早老蛋白1d E9基因(PSEN1d E9)人鼠淀粉样前蛋白融合体(APPswe,APP)双基因转染人胚肾293(human embryonic kidney 293,HEK293)细胞γ分泌酶活性及相关蛋白的影响,分析含药血清影响γ分泌酶活性相关蛋白的作用机制。方法以人APP/PS1双基因转染(HEK293)人胚肾细胞株为载体,将其分为5组,分别为空白组,7.5%HYD含药血清组,15%HYD含药血清组,HYD直接给药组,γ分泌酶抑制剂-DAPT组,复苏传代后采用细胞计数试剂盒CCK-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测HYD含药血清(大鼠灌胃10 d,取血清并进行血药成分检测)对人APP/PS1双基因转染细胞的生长活力和超微结构的影响;透射电镜观察各组细胞超微结构;双荧光素酶基因检测γ分泌酶活性;蛋白质印迹法(Western blot)检测γ分泌酶组件及相关蛋白早老素1(Presenilin 1,PS1)、鸟苷酸结合蛋白(GTP binding protein,CDC42)、热休克蛋白70羧基端作用蛋白(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein,CHIP)、前咽缺陷蛋白-1α(anterior pharynx defective-1α,Aph-1α)和低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达。结果 15%HYD含药血清组对细胞株的增殖作用高于其余各血清浓度组(P<0.05,P<0.01);透射电镜显示模型组线粒体膜不完整,有轻微肿胀,线粒体嵴模糊,胞质内有较多的脂褐素沉积,其余各组数量均有一定程度的好转和减轻。γ分泌酶活性结果,给药后24 h和48 h,与模型组比较,直接给药组、DAPT组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与DAPT组比较,15%HYD含药血清组差异有统计学意义(P<0.05)。γ分泌酶结果与模型组比较,各给药组的PS1蛋白、CDC42蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),CHIP蛋白表达和Aph-1α蛋白表达无统计学意义(P>0.05),而HYD直接给药组HIF-1α蛋白差异有统计学意义(P<0.05)。结论HYD含药血清具有改善人APP/PS1双基因转染细胞超微结构、抑制γ分泌酶活性的作用,其机制涉及促进CDC42蛋白的表达,抑制PS1蛋白水解生成PS1 CTF/NTF异二聚体,同时抑制HIF-1α蛋白的生成,进而降低γ分泌酶的活性。