人参二醇对APP-SH-SY5Y细胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信号通路的影响

目的:研究人参二醇(PD)对转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(APP-SH-SY5Y)中Tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制。方法:采用分子对接技术验证PD与非受体酪氨酸激酶Fyn的靶向性。在体外培养SH-SY5Y细胞,构建APP-SH-SY5Y细胞模型和绿色荧光蛋白(GFP)-SH-SY5Y细胞模型(对照细胞),通过检测细胞中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的表达来验证APP-SH-SY5Y细胞模型是否构建成功。以GFP-SH-SY5Y细胞为对照,采用CCK-8法检测5、10、20、30、40μmol/L的PD和125、250、500、1000、2000 nmol/L的PP2(Fyn抑制剂,阳性对照)作用24 h对APP-SH-SY5Y细胞存活率的影响,以确定最佳给药浓度。以APP-SH-SY5Y细胞为对象,分别检测最佳浓度PD、PP2作用24后细胞中Ca2+浓度及磷酸化Tau蛋白(p-Tau)/Tau、磷酸化非受体酪氨酸激酶Src(p-Src)/Fyn、磷酸化谷氨酸受体2B(p-GluN2B)/GluN2B比值。结果:分子模拟对接结果显示,PD可靶向结合Fyn蛋白。与GFP-SH-SY5Y细胞比较,APP-SH-SY5Y细胞中Aβ1-42蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。PD和PP2的最佳作用浓度分别为20μmol/L和500 nmol/L。20μmol/L PD、500 nmol/L PP2均可显著升高细胞的存活率,显著降低细胞中Ca2+浓度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。结论:PD可通过抑制Fyn/GluN2B信号通路来降低APP-SH-SY5Y细胞中Ca2+浓度及Tau蛋白的磷酸化水平。

佛手多糖对1-甲基-4-苯基-吡啶离子诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用研究

该文探究佛手多糖对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl-pyridine ion,MPP+)诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞损伤的保护作用及其机制。佛手多糖经大孔吸附树脂AB-8进行纯化。体外培养SH-SY5Y细胞,构建帕金森病(Parkinson′s disease,PD)细胞模型,实验分为对照组、MPP+模型组、佛手多糖组。采用噻唑蓝(methye thiazdye telrazlium,MTT)法检测细胞存活率,Hoechst33258染色法观察细胞形态,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位,蛋白免疫印迹(Western blot)检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases1/2,p-ERK1/2)和细胞色素c(cytochrome c,Cyt-c)蛋白表达水平。结果表明,佛手多糖的得率4.86%,纯度为44.46%,经过AB-8纯化后,纯度提高到60.81%;与对照组相比,模型组细胞的存活率显著降低,Hoechst33258染色下可见细胞破碎,细胞核皱缩,细胞内ROS显著增加,线粒体膜电位显著降低。与模型组相比,佛手多糖组的细胞存活率显著增加,细胞形态明显得到改善,ROS水平下降,线粒体膜电位升高。Western blot结果显示,佛手多糖能抑制MPP+引起的p-Akt和p-ERK1/2的降低,以及Cyt-c的上升。综上,佛手多糖对MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过调节线粒体ROS的产生和Cyt-c的释放,进而维持线粒体稳态,激活Akt信号通路和ERK信号通路,抑制细胞的凋亡,从而起到保护作用。研究结果可为缓解帕金森病的发生发展提供理论依据,同时也能更好地开发和利用佛手资源。

老化黑碳颗粒诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y炎症反应及机制

以人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象,分析被臭氧氧化的黑碳(oxidized black carbon,OBC)颗粒引起的炎症反应以及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)信号通路的作用.结果显示:随着OBC颗粒染毒质量浓度的增加(5、10、20、40µg/mL),细胞内线粒体跨膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平逐渐下降,DNA损伤程度逐渐升高,呈现质量浓度和时间依赖性;细胞外泌白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)水平升高和细胞内肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)基因高表达,说明OBC颗粒会促进SH-SY5Y细胞发生炎症反应;细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因表达量升高,且HO-1蛋白水平升高,说明细胞发生氧化应激;胞内NF-κB和PI3K/Akt通路相关蛋白显著变化,表明OBC颗粒激活了NF-κB和PI3K/Akt信号通路.综上,OBC颗粒可诱导SH-SY5Y细胞发生氧化应激造成DNA损伤,促进炎症反应,且对NF-κB和PI3K/Akt信号通路有重要调控作用.

灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

背景:目前研究证实,灵孢多糖可促进神经退行性相关疾病的神经再生。神经退行性疾病的发生与线粒体功能失调密切相关,但灵孢多糖对神经退行性疾病的细胞凋亡及线粒体功能的调控作用尚不明确。目的:探索灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控作用及机制。方法:SH-SY5Y细胞分为3组:对照组,过氧化氢组,灵孢多糖组。对照组细胞正常培养,过氧化氢组细胞用300μmol/L过氧化氢处理24 h,灵孢多糖组先用300μg/μL灵孢多糖干预一两个小时,然后加入300μmol/L过氧化氢干预24 h,干预结束后用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,TUNEL染色试剂盒检测细胞凋亡情况,丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶活性,免疫荧光染色法和Western blot法检测凋亡、线粒体动力学相关蛋白的表达。结果与结论:①与对照组相比,过氧化氢组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著降低,细胞凋亡率、丙二醇水平显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著增高,细胞凋亡率、丙二醛水平显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);②与对照组相比,过氧化氢组促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加,差异均有显著性意义(P<0.05);③与对照组相比,过氧化氢组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著增高,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低,差异均有显著性意义(P<0.05);与过氧化氢组相比,灵孢多糖组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达显著降低,线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达显著增高,差异均有显著性意义(P<0.05);④以上结果证实,灵孢多糖可通过改善线粒体功能障碍以减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

不同浓度阿达帕林诱导SH-SY5Y细胞的分化及凋亡

目的探讨不同浓度阿达帕林对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞形态学及功能的影响,以及诱导细胞分化及凋亡的作用。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、低浓度(0.1μM和1μM)阿达帕林组、高浓度(10μM)阿达帕林组。采用延时显微拍摄技术观察SH-SY5Y细胞形态学变化,采用免疫荧光染色法检测神经元特异性标志物β-微管蛋白Ⅲ和成熟神经元标志物神经丝重链多肽表达,采用多电极阵列记录SH-SY5Y细胞的电生理特征,细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。结果低浓度阿达帕林促进SH-SY5Y细胞突起形成,突起之间相互连接形成网络;低浓度阿达帕林处理SH-SY5Y细胞可见自发性放电活动。与对照组比较,1μM阿达帕林组SH-SY5Y细胞β-微管蛋白Ⅲ和神经丝重链多肽表达升高,高浓度阿达帕林组细胞凋亡水平升高(P<0.05)。结论低浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟的功能性神经元,高浓度阿达帕林可诱导SH-SY5Y细胞凋亡。

白藜芦醇对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用

目的研究白藜芦醇(Res)对H_(2)O_(2)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)氧化损伤的作用。方法选取一定剂量H_(2)O_(2)诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,通过检测Res对氧化损伤SH-SY5Y细胞的活力影响,筛选后续试验剂量。分别选取20,10,5,1μmol/L Res处理SH-SY5Y细胞24 h,加入1.2 mmol/L H_(2)O_(2),作用24 h,采用MTT法、生长曲线法测定细胞活力,流式细胞术测细胞周期,HE染色观察细胞形态,试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量及细胞外乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果1.2 mmol/L的H_(2)O_(2)造成SH-SY5Y细胞氧化损伤,细胞活力降低,细胞周期改变,细胞形态变化,SOD和GSH-Px活力下降,细胞内MDA含量、细胞外LDH活力升高(P<0.01)。与模型组相比,20,10,5μmol/L Res组细胞活力升高,G_(0)/G_(1)期和G_(2)/M期细胞百分率显著升高,S期降低(P<0.01);细胞内SOD和GSH-Px活力上升(P<0.01),MDA含量、细胞外LDH活力明显降低(P<0.01)。结论20,10,5μmol/L Res对H_(2)O_(2)诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤有一定的保护作用。

Myod1通过调节lncRNA SNHG15和miR-24-3p对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肌源性分化蛋白1(Myod1)对氧糖剥夺(OGD)诱导的SH-SY5Y细胞增殖抑制和凋亡的影响,并阐明其作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测正常对照组研究对象和缺血性脑梗死组患者外周血及正常培养的SH-SY5Y细胞(对照组)和OGD细胞模型(OGD组)细胞中Myod1和长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因15(SNHG15)mRNA表达水平。分别采用si-Myod1、pcDNA3.0-Myod1、si-SNHG15、pcDNA3.0-SNHG15、si-NC、空载质粒(Vector)、miR-NC和miR-24-3p模拟物(miR-mimics)质粒转染SH-SY5Y细胞后,进行OGD处理,将SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD组、OGD+Vector组、OGD+Myod1组、OGD+si-NC组、OGD+si-Myod1组、OGD+si-SNHG15组、OGD+si-SNHG15+Vector组、OGD+si-SNHG15+Myod1组、OGD+miR-NC组、OGD+miR-mimics组、OGD+miR-mimics+Vector组和OGD+miR-mimics+SNHG15组。采用CCK-8法检测各组细胞活性,采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色法检测各组EdU阳性细胞率,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测各组TUNEL阳性细胞率,采用Western blotting法检测各组细胞中裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved caspase-9)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(CHIP)法评估Myod1和SNHG15之间的关联。双荧光素酶报告基因实验评估Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p的靶向关系。结果:与正常对照组比较,缺血性脑梗死组患者外周血中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均升高(P<0.05)。与对照组比较,OGD组细胞中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。与OGD组比较,48和72 h时OGD+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均降低(P<0.01),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.01);OGD+si-Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01)。Myod1可与SNHG15的启动子序列结合。SNHG15可吸附miR-24-3p,Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p存在靶关系。敲低SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+si-SNHG15组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达miR-24-3p和SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics组细胞活性和EdU阳性细胞率升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+miR-mimics组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics+SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:Myod1可通过与SNHG15启动子区结合进而吸附miRNA-24,促进OGD诱导的SH-SY5Y细胞的增殖抑制和细胞凋亡。

长链非编码RNA-SNHG15调控缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的研究

讨论长链非编码RNA-SNHG15如何调节SH-SY5Y细胞在缺糖缺氧损伤下的增殖和凋亡。方法 构建缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型,通过MTT和AnnexinV/PI等方法分析SNHG15对细胞增殖和凋亡的作用,从而明确SNHG15调控细胞的增殖和凋亡的分子机制。结果 缺糖缺氧损伤SH-SY5Y细胞模型组SNHG15表达水平(4.48±0.12)明显高于常氧组(P<0.05);SiNC+OGD组(76.83±2.14)细胞的增值情况明显高于SiRNA+OGD组细胞(F=105.904;P=0.001),而细胞凋亡率则较之明显降低(F=2478.479;P=0.001),且细胞增殖结果为实验两组数据显著低于常氧组,细胞凋亡率结果为两组数据显著高于常氧组;与SiRNA+OGD组比较,SiNC+OGD组的细胞中Bax蛋白的表达显著减少,而Bcl-2和capase-3蛋白的表达则显著增加;与常氧组比较,两组细胞的Bcl-2、capase-3、Bax蛋白的表达均减少(F=80.146、P=0.001;F=3547.563、P=0.001;F=4164.163、P=0.001);P21在常氧组的表达明显低于其他组,SiRNA+OGD组中表达最高。结论 长链非编码RNA-SNHG15在调控缺糖缺氧损伤下的SH-SY5Y细胞增殖和凋亡中发挥作用。在缺血性脑卒中的兴奋毒性中,P21的表达迅速上调,通过增强促凋亡蛋白Bax的表达,从而诱导caspase3介导的凋亡途径或直接破坏线粒体膜通透性。

玉米黄素对内质网应激引发的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

目的:研究玉米黄素对内质网应激引起的细胞凋亡的保护作用。试验分为空白对照组、衣霉素(TM)损伤组(5μg/mL)、玉米黄素保护组(5μmol/L)和损伤加保护组。采用Caspase 3试剂盒检测Caspase 3活性的变化;采用Western Blot法测定凋亡相关蛋白PERK、CHOP,PERK下游信号分子elF2α和ATF4,以及自噬相关蛋白Beclin 1。结果显示:与TM模型组相比,玉米黄素处理后PERK及其下游调控蛋白elF2α和ATF4的表达能力显著下降(P<0.01),Beclin 1的水平显著升高(P<0.01)。与未加自噬抑制剂相比,玉米黄素组的GRP78水平显著升高(P<0.01)。与对照组相比,TM模型组的CHOP蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01),而玉米黄素处理组CHOP蛋白的表达水平极显著低于TM模型组(P<0.01)。结论:玉米黄素能减轻由内质网应激引起的损伤作用,并且可逆转TM引起的损伤。其作用机制是:玉米黄素通过抑制PERK通路,进而抑制GRP78与ERS感受器的分离,降低促凋亡因子CHOP的水平,通过调控保护性自噬来缓解ERS。

抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对MPP+处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及PD特征蛋白表达的影响

目的探讨抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理的SH-SY5Y细胞自噬、凋亡及帕金森病(PD)特征蛋白α-突触核蛋白(α-syn)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法以MPP+、PI3K/Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、PI3K/Akt抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率;吖啶橙(AO)染色检测自噬空泡;Western blot检测α-syn、TH、p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、p-mTOR、mTOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平。结果MPP+干预显著降低SH-SY5Y细胞存活率,且呈现剂量依赖性(P<0.05)。MPP+和IGF-1处理后SH-SY5Y细胞存活率降低,凋亡率增高(P<0.05);细胞中自噬空泡减少,LC3BⅡ/Ⅰ降低,p62蛋白水平增高(P<0.05);TH蛋白水平降低,α-syn蛋白水平增高(P<0.05);p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt与p-mTOR/mTOR增高(P<0.05)。LY294002对SH-SY5Y细胞的影响与MPP+和IGF-1相反,且LY294002可在一定程度上逆转MPP+对SH-SY5Y细胞的影响(P<0.05)。结论抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有保护作用。

circPVT1靶向调控miR-195-5p/SOX9轴影响结肠癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化

目的:探究环状RNA浆细胞瘤变体易位1(circPVT1)靶向调控微小RNA-195-5p(miR-195-5p)/性别决定区Y框蛋白9(SOX9)轴对结肠癌细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的影响。方法:体外培养人正常结肠上皮细胞NCM-460、人结肠癌细胞系(SW480、HCT116、HCT29、LOVO、SW620)至对数期,将SW480细胞分为对照组(正常培养SW480细胞不进行转染)、空载质粒组(转染空载质粒)、circPVT1沉默组[转染circPVT1小干扰RNA(siRNA)质粒]、miR-195-5p过表达组[转染miR-195-5p模拟物(mimics)质粒]、SOX9沉默组(转染SOX9 siRNA质粒)、circPVT1沉默+miR-195-5p低表达组(转染circPVT1 siRNA和miR-195-5p siRNA质粒)。各组转染相应质粒后培养48 h。荧光定量PCR法检测NCM-460细胞、人结肠癌细胞系(SW480、HCT116、HCT29、LOVO、SW620)和各组SW480细胞circPVT1、miR-195-5p、SOX9 mRNA的表达;噻唑蓝和流式细胞仪分别检测各组SW480细胞增殖和凋亡;蛋白印迹法检测各组SW480细胞SOX9、凋亡和EMT相关蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测circPVT1与miR-195-5p、miR-195-5p与SOX9的靶向关系。结果:与NCM-460细胞比较,SW480细胞、HCT116细胞、HCT29细胞、LOVO细胞、SW620细胞中circPVT1、SOX9 mRNA表达显著升高,miR-195-5p表达显著降低(P<0.05);其中,SW480细胞中circPVT1、SOX9 mRNA表达最高,miR-195-5p表达最低;故选择SW480细胞进行后续实验。与对照组和空载质粒组比较,circPVT1沉默组circPVT1、SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低,miR-195-5p表达显著升高(P<0.05);miR-195-5p过表达组miR-195-5p表达显著升高,SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05);SOX9沉默组SOX9 mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05)。与对照组和空载质粒组比较,circPVT1沉默组、miR-195-5p过表达组、SOX9沉默组细胞增殖率、Bcl-2、Vimentin蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。与circPVT1沉默组比较,circPVT1沉默+miR-195-5p低表达组miR-195-5p、凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白表达显著降低,SOX9 mRNA及蛋白、细胞增殖率、Bcl-2、Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.05)。circPVT1与miR-195-5p、miR-195-5p与SOX9存在靶向调控关系。结论:沉默circPVT1可以靶向上调miR-195-5p表达,抑制SOX9表达,进而抑制SW480细胞增殖和EMT进程,促进其凋亡。

miR-155-5p靶向下调SOCS1减轻脂多糖诱导的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞炎症损伤

目的探讨微小RNA-155-5p(miR-155-5p)对脂多糖(LPS)诱导SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞神经炎症损伤的影响。方法采用人SH-SY5Y细胞,设立miR-155-5p过表达及其阴性对照(miR-155-5p mimic组、mimic-NC组)和miR-155-5p低表达及其阴性对照(miR-155-5p inhibitor组、inhibitor-NC组),将LPS处理上述各组转染成功细胞24 h,并设置未转染SH-SY5Y细胞的对照组和LPS处理组(LPS组)。噻唑蓝(MTT)法检测SH-SY5Y细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,反转录PCR法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-10 mRNA水平和miR-155-5p表达,Western blot法检测细胞裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、磷酸化核因子κB p65/核因子κB p65(p-NF-κB p65/NF-κB p65)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK/p38 MAPK)蛋白水平。采用miR-155-5p模拟物(miR-155-5p mimic)、miR-155-5p抑制物(miR-155-5p inhibitor)调节SH-SY5Y细胞miR-155-5p表达,生物信息学预测miR-155-5p与细胞因子信号传送阻抑物1(SOCS1)靶向关系并进行荧光素酶实验验证。构建miR-155-5p与SOCS1均下调的SH-SY5Y细胞(miR-155-5p inhibitor/si-SOCS1组),采用上述方法检测细胞活性、细胞凋亡、炎性细胞因子mRNA表达以及SOCS1蛋白表达和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值。结果与对照组相比,LPS组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达降低,细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平升高,miR-155-5p表达量和p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值升高。与LPS组相比,miR-155-5p inhibitor组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达升高,miR-155-5p表达量、细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值降低。与LPS组相比,miR-155-5p mimic组SH-SY5Y细胞活性、Bcl2蛋白表达、IL-10 mRNA水平、SOCS1蛋白表达降低,miR-155-5p表达量、细胞凋亡率、c-caspase-3和BAX蛋白表达、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值增加。miR-155-5p与SOCS1具有靶向关系,与miR-155-5p inhibitor组相比,miR-155-5p inhibitor/si-SOCS1组细胞活性、IL-10 mRNA水平降低,细胞凋亡率、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平升高。结论抑制miR-155-5p表达可减轻LPS诱导的神经炎症损伤,可能与靶向下调SOCS1表达有关。

右美托咪定减轻缺氧诱导的人神经母细胞瘤细胞系SH⁃SY5Y损伤

目的研究右美托咪定(DEX)在缺氧环境下对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y的保护作用及其机制。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、缺氧组(终浓度为1.2 mmol/L CoCl_(2)处理24 h)和DEX干预组(终浓度为1.2 mmol/L CoCl_(2)和10μmol/L DEX处理24 h)。显微镜观察细胞形态;MTT比色法、TUNEL染色法和annexin V-FITC/PI染色法检测细胞活性和细胞凋亡;Western blot检测cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、p75^(NTR)和p-NF-κB蛋白表达。结果与对照组比较,缺氧组细胞的胞体变小(P<0.01)、细胞活性降低(P<0.01)、凋亡增加(P<0.01),细胞中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、p75^(NTR)和p-NF-κB蛋白表达水平均明显增加(P<0.01)。DEX干预能显著缓解缺氧组的上述变化(P<0.01)。结论DEX可能通过抑制p75^(NTR)表达和NF-κB活性缓解缺氧导致的SH-SY5Y细胞损伤。

去亚甲基小檗碱对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡的影响

目的探讨去亚甲基小檗碱(DMB)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。方法培养SH-SY5Y细胞,将其分为对照组、MPP+组、小檗碱(BBR,DMB的前体)+MPP+组、司莱吉兰(selegiline,与DMB同为单胺氧化酶B抑制剂)+MPP+组、DMB+MPP+组。应用免疫印迹法检测各组bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比,MPP+组bcl-2/bax比值明显降低(F=42.58,q=17.89,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理均可以抑制MPP+诱导的bcl-2/bax比值降低(q=6.71~10.63,P<0.001),且selegiline处理效果强于BBR和DMB(q=3.93、3.59,P<0.05)。与对照组相比,MPP+组cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(F=111.60,q=29.44,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理可以降低MPP+诱导的cleaved caspase-3蛋白表达上调(q=10.74~13.53,P<0.001),且3种药物处理效果差异无显著性。结论对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞,DMB可以升高bcl-2/bax比值,降低cleaved caspase-3蛋白的表达。

稳定表达未折叠蛋白反应荧光报告基因的SH-SY5Y细胞系建立

目的通过稳定表达70 kD热休克蛋白(HSP)4重组蛋白(HSPA4)-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的SH-SY5Y细胞系,直观实时反映细胞内未折叠蛋白反应(UPR)的变化。方法以SH-SY5Y细胞的cDNA为模板,克隆HSPA4,并连接EGFP。将HSPA4-EGFP连接入慢病毒载体中,慢病毒转染SH-SY5Y细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素处理细胞1个月,筛选得到HSPA4-EGFP稳转系。通过实时荧光定量聚合酶链反应(QPCR)、Western印迹、共聚焦显微镜检测等方法,证实HSPA4-EGFP稳转系能有效且实时反映UPR的变化。结果扩增到HSPA4-EGFP,并成功构建HSPA4-EGFP稳定表达的UPR报告系统。QPCR检测表明,构建的报告系统可以指示UPR。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内绿色EGFP的点状分布,其能够反映UPR错误折叠蛋白的多少及分布,分别加入UPR激活剂、抑制剂后,细胞内绿色EGFP的点状分布明显增多和减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测到细胞中HSPA4-EGFP融合蛋白表达条带。结论成功构建HSPA4-EGFP稳转系,能够直观实时反映UPR变化,为深入研究UPR及其相关疾病(包括老年性疾病)提供工具。

银杏叶提取物通过ERK1/2信号通路降低OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

目的:探究银杏叶提取物(EGb761)经细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法:将SH-SY5Y细胞随机分为control、OGD/R和EGb761(25、50、100和200μg/ml)组,OGD/R组细胞置于无糖无氧环境中探究最佳氧糖剥夺(OGD)时间,OGD/R组和EGb761组细胞在氧糖剥夺后迅速复糖复氧培养24 h, EGb761组于复糖复氧后给予不同浓度的EGb761培养24 h,并加入ERK1/2通路抑制剂PD98059进行干预,利用CCK-8法检测SH-SY5Y细胞活力;流式细胞术检测SH-SY5Y细胞凋亡情况;Western Blot检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9水平变化以及p-ERK1/2/ERK1/2比值的变化。结果:SH-SY5Y细胞随着缺氧时间的延长形态逐渐变圆,活力逐渐下降,最佳OGD时间为4 h(P<0.05)。与OGD/R组相比,EGb761组细胞活力显著提高,p-ERK1/2/ERK1/2比值升高,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9水平降低,细胞凋亡率降低,EGb761发挥作用的最有效浓度为50μg/ml(P<0.05)。加入PD98059后,p-ERK1/2/ERK1/2比值降低,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9水平升高,细胞活力降低(P<0.05)。结论:EGb761可经ERK1/2信号通路抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,发挥神经保护作用。

衰老SH⁃SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立

目的:探讨衰老SH‑SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型的建立。方法:将SH‑SY5Y细胞随机分为对照(D‑半乳糖0 mmol/L)、D‑半乳糖(25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L)组,分别给予对应浓度的D‑半乳糖处理48 h,显微镜观察细胞形态的改变、β‑半乳糖苷酶试剂盒检测β‑半乳糖苷酶活性、EdU试剂盒检测细胞增殖率以及CCK‑8法检测细胞存活率,确定D‑半乳糖致衰浓度,建立衰老模型。将衰老SH‑SY5Y细胞随机分为对照(氧糖剥夺不处理)、氧糖剥夺处理(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h)组,随后复糖复氧24 h,CCK‑8检测衰老SH‑SY5Y细胞存活率。结果:25 mmol/L、50 mmol/L组的细胞形态、β‑gal活性与对照组比较没有明显变化(P>0.05),100 mmol/L组细胞可见胞体肥大,200 mmol/L组细胞染色质固缩,400 mmol/L组细胞出现大量空泡化;(100 mmol/L~400 mmol/L)组细胞β‑半乳糖苷酶染色阳性率与对照组比明显升高(P<0.05),100 mmol/L、200 mmol/L组间差异不大(P>0.05);(100 mmol/L~400 mmol/L)组细胞增殖能力明显下降,呈浓度依赖性降低(P<0.05);细胞存活率呈浓度依赖性降低(P<0.05),IC50在100 mmol/L和200 mmol/L之间。衰老SH‑SY5Y细胞存活率呈氧糖剥夺时间依赖性降低(P<0.05),IC50接近1 h。结论:D‑半乳糖浓度为100 mmoL/L且作用细胞48 h,可建立存活率约50%的衰老SH‑SY5Y细胞模型,氧糖剥夺衰老SH‑SY5Y细胞1 h再灌注24 h可建立存活率接近50%的衰老SH‑SY5Y细胞氧糖剥夺/再灌注模型。

远隔缺血预适应大鼠血清外泌体减轻氧糖剥夺的SH-SY5Y细胞损伤

目的:探讨远隔缺血预适应(RIPC)大鼠血清外泌体(RIPC-Exo)对氧糖剥夺(OGD)处理的人神经母细胞瘤来源的细胞系SH-SY5Y细胞的保护作用。方法:对成年SD大鼠进行RIPC处理,利用试剂盒提取血清中外泌体,用Western Blot检测外泌体特异性标志物CD9和CD63的表达。SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD处理组、正常大鼠血清源性外泌体处理组(OGD+Normal-Exo)和RIPC大鼠血清源性外泌体处理组(OGD+RIPC-Exo)。利用CCK-8方法检测SH-SY5Y细胞活性,利用商品化试剂盒检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)的活性和细胞内丙二醛(MDA)的含量,利用Annexin V/PI染色和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:RIPC-Exo处理可显著增加OGD处理SH-SY5Y细胞的活性,降低培养上清中LDH活性,以及细胞中MDA的含量。此外RIPC-Exo处理显著减少OGD诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。结论:RIPC大鼠产生外泌体能减轻OGD诱发的SH-SY5Y细胞损伤,这可能是RIPC对远隔器官发挥保护作用的机制之一。

柴胡皂苷d对SH-SY5Y细胞体外抑制作用及机制

目的探究柴胡皂苷(SS)d对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的体外抑制作用及分子机制。方法体外常规培养神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,分别在浓度0、4、8、10μmol/L SSd的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)中作用48 h,设为对照组及4、8、10μmol/L SSd组,荧光探针(DCFH-DA)法检测各组细胞中活性氧(ROS)的产生情况,试剂盒检测不同浓度SSd对SH-SY5Y细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)含量的影响;Western印迹法检测细胞内细胞周期蛋白(Cyclin)D1、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及Bcl-2相关X基因(Bax)表达水平。结果与对照组相比,8、10μmol/L SSd组ROS水平、MDA含量显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),且有浓度依赖趋势;4、8、10μmol/L SSd组LDH活性、Bax蛋白表达明显升高,CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论SSd能够通过提高细胞的氧化应激水平,抑制CyclinD1信号转导通路而促进SH-SY5Y细胞凋亡。

钙蛋白酶在TOCP诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的调节作用

目的探究钙蛋白酶对三邻甲苯基磷酸酯(TOCP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬的调节作用。方法不同浓度TOCP处理未分化和分化的SH-SY5Y细胞,用荧光分光光度法检测钙蛋白酶活性。抑制钙蛋白酶活性后,通过Western blotting检测TOCP对自噬相关蛋白的影响;抑制钙通道后,用荧光分光光度法检测胞质钙离子浓度对钙蛋白酶活性的影响。结果TOCP诱导未分化和分化的SH-SY5Y细胞钙蛋白酶活性上升;钙蛋白酶抑制剂可降低TOCP诱导的自噬相关蛋白LC3-II和Beclin1表达。维拉帕米和2-APB阻断钙通道后钙蛋白酶活性降低,维拉帕米而非2-APB可以抑制TOCP诱导的自噬相关蛋白LC3-II表达。结论TOCP在未分化和分化的SH-SY5Y细胞中诱导的自噬受钙蛋白酶活性的调节。