大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与高效表达

从猪粪便中分离并筛选出高效生产酸性植酸酶和磷酸酶双功酶(appA植酸酶)的大肠杆菌菌株。通过PCR方法从该菌株基因组中扩增获得了植酸酶基因appA,测序结果显示该基因编码区全长1,299个核苷酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,通过转化的大肠杆菌BL21在试管摇床培养条件下得到了高效表达,其表达量达到692U/mL。酶学特性分析表明其反应的最适pH为4.5,最适温度为60℃。

大肠杆菌植酸酶appA的融合表达及耐热性研究

提取大肠杆菌(SUGL)基因组DNA,通过PCR方法从基因组扩增得到植酸酶基因ap-pA,测序结果表明该基因的ORF读框包含1440个核苷酸.将该基因重组于大肠杆菌表达载体pET-32a(+)中,导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌BL21(DE3)-pET32a-appA.对表达条件进行了优化,在30℃下,以0.1mmol/L IPTG诱导表达植酸酶,表达量达到10%以上.在37℃,用钒钼酸铵法测定了表达的植酸酶活性为40740.7U/g,同时观察不同加热温度对植酸酶活性的影响程度.发现融合表达的植酸酶的耐热性得到提高.

大肠杆菌植酸酶appA基因的克隆、表达及性质分析

通过维生素C-钼蓝法,从饲喂青饲料的猪的粪便中分离筛选出1株产较高活性appA植酸酶的大肠杆菌菌株;采用PCR方法从该菌株的基因组中克隆获得植酸酶appA基因,测序结果显示PCR产物全长1447 bp,该植酸酶基因编码区有1296个核苷酸,编码432个氨基酸。将该编码区克隆至pPIC9K载体,并转化入巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导表达,获得了约55 k Da的特征条带,表达96 h后其上清液的酶活力达到368 U/m L。经Ni亲和柱纯化后进行部分酶学性质分析,结果表明:重组appA植酸酶的最适反应温度为55℃,温度高于60℃后其酶活下降明显;其最适pH值为5.0。

大肠杆菌植酸酶appA2基因联合人MxA基因真核表达载体的构建及表达研究

本研究旨在探讨通过构建同时表达大肠杆菌植酸酶appA2及人抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)的真核表达载体,比较双基因表达载体和相应单基因表达载体中外源基因的表达效率;从pcDNA-ap-pA2载体上扩增CMV-appA2-BGHpA片段,通过MluI酶切位点连接到pcDNA-MxA载体中,构建重组载体pcDNA-appA-MxA(下称AMP),分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-MxA、pcDNA-appA2及AMP质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,取细胞通过实时荧光定量PCR测定细胞内appA2及MxA的表达,同时部分细胞通过Westernblot测定细胞内MxA蛋白表达量,采用改进的钼酸铵显色法测定细胞内植酸酶活性;酶切及测序结果表明成功构建了AMP载体;QRT-PCR结果表明,转AMP细胞组MxA表达水平是转pcDNA-MxA组的1.118倍,转AMP细胞组appA2表达水平是转pcDNA-appA2组的1.134倍,上述各组间差异显著(P<0.05)。灰度分析结果表明,AMP细胞组细胞内MxA表达量是转染pcDNA-MxA细胞组的1.07倍;植酸酶活性测定试验结果表明,转AMP、pcDNA-appA2细胞组及对照组细胞内植酸酶酶活和对照组平均酶活分别为0.294、0.235及0.082FTU·μL-1,2个试验组间差异不显著,试验组和对照组间差异极显著(P<0.01);试验结果表明本研究构建双基因表达载体中外源基因的表达效率比相应单基因表达载体表达效率高,本研究为以后多基因共表达及制备多基因转基因动物奠定了基础。

大肠杆菌植酸酶基因appA及其过量表达

综述了植酸酶基因工程的研究进展 ,着重介绍了一种颇具前途的细菌植酸酶基因appA及其过量表达方面的研究 ,并对该酶的酶学性质特别是其在动物生理条件下所表现出的性质进行了初步总结。讨论了当前植酸酶研究中存在的一些困难 ,并对其进一步研究进行了展望。

大肠杆菌植酸酶appA2基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达

根据已经公布的植酸酶appA2基因序列,设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶appA2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组真核表达质粒pcDNA-appA2,对重组表达质粒鉴定正确后,转染猪PK15细胞,经G418筛选后,通过实时荧光定量PCR检测细胞内appA2表达,同时测定细胞内植酸酶的活性,检测结果表明,本试验成功构建了pcDNA-appA2重组真核表达载体,转染细胞后appA2的表达量是对照组的1 686.55倍,同时具有较好的植酸酶活性,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。

多位点突变提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性

为提高大肠杆菌植酸酶AppA(一种已得到广泛应用的饲料添加剂,其酶活高,pH作用范围广,但热稳定性较差)热稳定性,在appA基因上组合突变了W46E、Q62W、A73P、K75C、S146E、R159Y、N204C、Y255D、Q258N和Q349N等10个位点,突变后的基因命名为appAM10。将野生型appAppA和突变体appAM10ppAM10基因转入毕赤酵母GS115进行表达,并对重组蛋白AppA和AppAM10进行了酶学性质研究与比较。结果表明:AppAM10分子量约为55kDa,比活性为3022U/mg,AppAM10的K_m=330μmo1/L,V_(max)=3147U/mg。AppAM10的最适pH值为4.5,最适反应温度为65℃。与野生型的AppA的最适pH无明显区别,比AppA的最适温度提高了5℃。经90℃孵育15min后,AppA完全失活,而AppAM10仍残留17.5%的活性,T_m值提高约8℃,说明上述10个位点的组合突变有利于提高大肠杆菌植酸酶AppA热稳定性,其中与N-糖基化有关的N204C、Q258N和Q349N3个位点可能起着重要作用。

密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子使用偏爱性,对Escherichia coli来源的高比活植酸酶基因（appA）全面地进行密码子优化,人工合成了植酸酶基因（appA-P）,并将该基因克隆到毕赤酵母诱导型分泌表达载体pHBM905A上,获得重组质粒pHBM905A-appA-P,通过PEG1000转化法将线性化的重组质粒转化毕赤酵母GS115菌株,筛选得到一个高效表达植酸酶的重组菌株GS115-appA-P,在25℃摇瓶培养168 h后酶活力达到422 U/mL,该植酸酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为4.5,在20-50℃、pH1.0-6.0范围内较稳定.

一种基于APPA的码辅助载波同步算法

在低信噪比环境下,小的频偏和相偏的存在会使Turbo编码系统的译码性能恶化,所以必须结合迭代译码系统,对信号的残留频偏和相差进行估计。该文提出一种改进的残留频偏载波相位估计算法——后验概率辅助(APPA)相位估计,该算法将译码器输出的外信息用于辅助迭代的相位估计。环路滤波器将相位误差信号转换成控制信号,控制数控振荡器的输出,这样可以得到待估计的相位误差。仿真表明,在极低信噪比下(比如,SNR<-7.8dB)该算法在同时存在频偏和相偏的时候能正常工作,其性能非常接近理想同步条件下的性能。

提升企业信息化效率网宿APPA应用加速首发

本刊讯近日，网宿科技正式对外发布自主创新的APPA企业应用加速解决方案，可大幅提升企业信息化系统的网络访问速度，同时对系统负载能力实现实时扩充，对网络安全防护能力有极大改善与提高。它是国内第一次在网络层面上以服务模式为企业信息化应用提供的加速解决方案。“现阶段，面对互联网访问的诸多制约，比如南北运营商之间的访问瓶颈、骨干网络抖动、安全问题以及国际问网络不稳定等，亟需一种解决方案可以有效提高网络的可用性、稳定性以及访问体验。网宿APPA正是在这样的需求促使下推出的。”网宿科技副总裁刘洪涛表示。

核转录因子-κappa B在1,2-二氯乙烷中毒所致基质金属蛋白酶-9表达上调过程中的作用

目的探究核转录因子-κappa B(nuclear transcription factorκappa B,NF-κB)在1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)中毒引起的基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达上调以及脑水肿形成过程中的作用。方法选取40只雌性昆明种小鼠随机分为对照组及3个染毒组。染毒组小鼠置于100 L静式染毒柜中,每天染毒1,2-DCE 1.2 mg/L×3.5 h,分别染毒1 d、2 d和3 d。观察脑组织病理切片,检测各组小鼠的脑含水量、MMP-9以及NF-κB的P65、P50亚基蛋白和mRNA表达水平。结果染毒3 d组的小鼠出现抱抓现象,染毒2 d和3 d组小鼠出现典型脑水肿病理改变,脑含水量、MMP-9以及NF-κB的P65蛋白和mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。结论 1,2-DCE可通过诱导小鼠脑组织中NF-κB的活性亚基(P65)表达增强上调MMP-9的表达,从而导致血脑屏障通透性增加,最终引起脑水肿的发生。

m6A甲基转移酶METTL3通过β‐arrestin 1/p65调控结肠癌细胞增殖

目的探讨m6A甲基转移酶METTL3通过β-arrestin 1/p65在结肠癌细胞中的作用机制。方法使用结肠癌细胞系HCT116,应用荧光定量PCR、Western blot测定结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1及增值蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达水平;利用细胞转染及细胞克隆实验,观察METTL3、β-arres-tin1和p65在结肠癌细胞增殖中的作用。结果METTL3和β-arrestin 1在结肠癌细胞中表达升高(以actin作为内参基因,与正常对照组比较,P<0.05)。结肠癌细胞转染METTL3-shRNA后,转染组灰度(0.36±0.046)较对照组(1.27±0.14)明显减少(P=0.0004);与对照组克隆数(465±42)比较,转染组细胞增殖(85±37)明显减少(P<0.05);细胞增殖蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达也明显减少(分别为P<0.01、0.05、0.01);结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1和p-p65蛋白表达均增高(均为P<0.05)。随后HCT116细胞沉默MET-TL3的表达,发现细胞中β-arrestin 1、p-p65蛋白的表达明显下降(均为P<0.05)。结论METTL3影响结肠癌细胞的增殖可能通过β-arrestin 1/p65调控参与肿瘤的发生发展。

基于时间序列变密度处理的负荷曲线聚类分析

负荷曲线聚类是分析用户负荷特性的基础,能够从大量负荷数据中挖掘典型用电模式,了解用户电力消费的特点,对需求响应、电价设计、电网规划等应用具有重要意义。针对现有聚类方法对负荷时段特征考虑不足的问题,为提升聚类精度和满足实际应用需求,提出一种基于时间序列变密度处理的聚类方法。首先,采用线性插值法增加峰、谷、爬坡等3个关键时段数据点的密度,突出和放大其在聚类中的影响,并基于自适应分段聚合近似(adaptive piecewise aggregate approximation,APAA)降维方法减小冗余数据密度。然后,结合欧式距离和相关距离构建综合指标,对负荷曲线开展k-medoids聚类分析。最后,利用UCI数据集的居民用户实测数据对所提方法进行验证。实验结果表明,该方法能有效改善负荷聚类效果,真实反映了居民用户的用电特性。

大肠杆菌植酸酶的原核表达及酶学性质

将大肠杆菌植酸酶appA基因重组于表达载体pET32a中,导入大肠杆菌Origami(DE3)构建工程菌Origami(DE3)-pET32a-appA.对表达的appA重组植酸酶经Ni柱亲和纯化、SDS-PAGE分析表明,纯化后条带单一,酶的纯度较高.对其酶学性质的研究表明,该酶反应的比活力为3.36×106U/mg;最适pH为4.5;最适温度为60℃;在80℃和85℃的耐干热能力超过耐湿热能力;在37℃下,Mg2+﹑Ca2+﹑Mn2+对酶活性有促进作用,Co2+﹑Cu2+﹑K+对酶活性有不同程度的抑制作用,而Fe3+和Zn2+对酶活性有强烈的抑制作用;此外,该酶还具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力.

化瘀通络中药对糖尿病肾病瘀血阻络证大鼠肾皮质核因子-κB表达的影响

探讨化瘀通络中药对糖尿病肾病(DN)瘀血阻络证大鼠肾皮质核因子-κB表达的影响。60只大鼠选取10只为正常组,余大鼠予高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病模型,成模大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组及中药组,相应药物剂量灌胃,16周末测量各组大鼠饮水量、饮食量、尿量、体重及空腹血糖。检测不同时间点(第3天、第8周、第16周)各组大鼠24 h尿蛋白定量(24 h UTP)的变化,留取肾皮质观察肾脏病理损伤及采用Real-time PCR、Western-blot检测NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达。结果显示与正常组比较,模型组大鼠出现明显多饮、多食、多尿、消瘦的症状(P<0.05),第8、16周24 h UTP明显增多(P<0.05),NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达增强(P<0.05),肾脏病理出现明显损伤;与模型组比较,两干预组在第8周、16周24h UTP明显减少(P<0.05),NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达明显下调(P<0.05),中药组饮水量、尿量、体重有显著改善(P<0.05);与厄贝沙坦组比较,中药组饮水量、第16周24 h UTP及NF-κB p65蛋白表达明显减少(P<0.05)。结果表明化瘀通络中药抑制NF-κB p65的高表达可能是该药物对DN大鼠肾脏保护作用的靶点之一。

紫细菌光合机构及光合作用基因的表达调控

紫细菌是研究细菌光合作用的重要生物。介绍了紫细菌光合机构捕光色素蛋白复合体Ⅰ(light-harvesting I)、捕光色素蛋白复合体Ⅱ(light-harvesting II)和光化学反应中心(reaction center)的结构,并探讨了其光合作用基因的转录调控机制,重点阐述了PpsR/AppA系统对紫细菌光合作用基因的转录调控。

pEGFP-植酸酶基因质粒重组构建及其在COS7细胞中表达分析

采用PCR技术扩增细菌酸性植酸aPPA2基因ORF序列,其DNA分子为1 299 bp,编码432氨基酸,蛋白质分子量约为48 kD a。此植酸酶基因被克隆到pEGFP-N3表达载体的BamH1和Pst1克隆区域,重组的pEG-FP-aPPA2重组质粒经转化到哺乳类培养细胞COS7中。重组的pEGFP-N3-aPPA2在COS7细胞中正常表达并检测出高的植酸酶活性。本研究提出的pEGFP-N3-aPPA2重组质粒构建和在哺乳类COS7细胞表达体系为植酸酶生产提供了新的技术线路。

缺血预处理和吡那地尔预处理对NF-κB的影响及其心肌保护作用

目的:观察缺血预处理和吡那地尔预处理对心肌核转录因子(NF-κB)活性的影响,进一步探讨预处理心肌保护机制。方法:健康日本大耳白兔80只随机分为5组,分别为空白对照组(C组)、去极化组(K组)、缺血预处理组(I组)、吡那地尔预处理组(P组)和格列本脲阻断组(G组)。建立离体心脏Langendorff模型,待心率平衡10min后全心缺血40min,复灌60min或120min。分别于平衡10min和复灌15min、30min、60min和120min时检测心功能指标;平衡10min和复灌30min时冠脉流量(CF);平衡10min、复灌60min和120min心肌NF-κBP65的表达情况。结果:(1)复灌后I组和P组各项心肌功能和CF恢复率均优于C组和K组(P<0.05或P<0.01)。(2)复灌后60min和120min时,I组和P组心肌细胞胞核NF-κBP65平均灰度值高于C组和K组(P<0.05或P<0.01);G组心肌细胞胞核NF-κBP65平均灰度值较P组降低(P<0.05)。结论:缺血预处理和吡那地尔预处理均能对心肌起到良好地保护作用,其保护机制可能是通过开放ATP敏感性钾通道直接或间接抑制NF-κB激活,进而减轻心肌缺血再灌注损伤。