基于高分辨质谱技术的黄芪多糖APS-Ⅱ酶解活性寡糖特征分支位点的研究

黄芪多糖是黄芪中免疫调节活性最强,含量最为丰富的物质,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫促进等多种生物活性,临床应用广泛。前期研究发现黄芪多糖主要由2种不同相对分子质量多糖APS-Ⅰ(>2000 kDa)、APS-Ⅱ(10 kDa)组成,APS-Ⅱ(10 kDa)为黄芪多糖中活性最强组分,并采用α-1,4-葡聚糖内切酶将APS-Ⅱ降解为寡糖,通过体外免疫活性筛选发现2~9糖整体免疫活性较低,而10~14糖具有较强的免疫活性,且活性优于未降解的APS-Ⅱ。为了探究APS-Ⅱ降解寡糖发挥免疫活性的关键结构,本文采用MALDI-TOF-MS生物质谱以及高分辨质谱仪器ESIQ Exactive-MS对APS酶解寡糖进行解析,通过对比发现10~14糖中存在1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构,推测1→4和1→6两种连接方式共存的支链结构为APS-Ⅱ发挥免疫活性的关键结构,为黄芪多糖和寡糖的构效关系研究奠定理论基础。

体外模拟消化对黄芪多糖APS-Ⅱ结构和免疫活性的影响

目的从黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)中分离制备APS-Ⅱ,探究其体外消化后产物的结构和免疫活性的变化。方法采用体外模拟唾液、胃液和肠模型研究APS-Ⅱ经唾液、胃液和小肠液消化后的相对分子质量分布、单糖组成、还原糖含量、官能团和表面形态的变化,同时进行体外免疫活性实验,比较APS-Ⅱ经体外消化以后的形式及活性的变化。结果唾液对APS-Ⅱ无明显影响;而在胃消化0~6 h的过程中,多糖的相对分子质量从5.956×10^(3)降至3.745×10^(3),还原糖含量从0.333 mg/mL增加至0.348 mg/mL,红外光谱显示在1649~1029 cm^(-1)吸收峰强度不同,游离单糖半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)被释放;甲基化结果显示发现APS-Ⅱ经唾液、胃液消化后,糖苷键以1,4葡萄糖连接为主;肠液消化产物中糖苷键存在1,3半乳糖连接。体外免疫活性实验表明,肠液消化产物促进RAW264.7巨噬细胞吞噬活力以及释放一氧化氮(nitric oxide,NO)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的能力较强。结论APS-Ⅱ在胃肠道中可以被消化,且经胃肠液消化后免疫活性增强,推测与其相对分子质量、单糖组成和糖苷键连接方式相关。

黄芪多糖APS-Ⅱ在M细胞上的转运吸收机制初探

通过建立M细胞模型,探究黄芪多糖APS-Ⅱ在体内的吸收机制。首先将黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)通过超滤法分为2种不同相对分子质量多糖APS-I(>2000 kDa)和APS-II(10 kDa),并制备出黄芪多糖APS-Ⅱ(10 kDa),然后对其进行荧光标记;同时通过Caco-2细胞和Raji细胞构建M细胞模型,并对其进行模型验证。采用转运抑制剂对M细胞模型进行处理,探究黄芪多糖APS-Ⅱ在M细胞上的转运情况。结果显示,通过结构与活性验证FITC已成功标记到了APS-Ⅱ的末端,同时M细胞模型构建成功,并发现APS-Ⅱ可以被M细胞所转运,通过5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、染料木素(genistein)、dynasore和诺考达唑(nocodazole)4种转运抑制剂说明APS-Ⅱ可能通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用进入细胞。

黄芪活性多糖APS-Ⅱ的酸降解及其降解寡糖的结构和免疫活性研究

课题组前期研究发现黄芪免疫活性多糖APS-Ⅱ具有较强的免疫活性,鉴于其分子量较大且结构复杂,本文旨在建立APS-Ⅱ酸降解的最优方法,对降解产物进行结构初探与分离制备以后,通过体外免疫细胞实验筛选免疫活性最强的寡糖活性中心。本研究以APS-Ⅱ为研究对象,采用“自上而下”的研究策略,首先通过单因素试验和正交试验优化了APS-Ⅱ酸降解的最佳条件,接着以最佳条件制备的黄芪寡糖通过亲水作用色谱-电喷雾电离源-高分辨飞行时间质谱进行结构解析,然后将黄芪寡糖通过纯化制备色谱仪分离制备不同聚合度的寡糖片段,最后利用体外免疫细胞从多角度筛选免疫活性中心片段。结果表明APS-Ⅱ的最佳酸解条件为水解温度80℃,三氟乙酸浓度1.0 mol·L-1,水解时间1 h;该降解条件具有良好的重复性;降解产物黄芪寡糖含有主链1→4连接的六碳醛聚糖结构;6个寡糖片段的免疫活性筛选实验表明分子量较大的寡糖具有更强的免疫促进作用,推测黄芪寡糖的免疫活性中心位于聚合度DP9~DP19的糖链中。动物福利和实验过程均遵循山西大学动物伦理委员会的规定。该结果对其他中药寡糖的研究具有一定示范作用,为黄芪寡糖的结构表征及构效关系研究奠定基础,同时可以促进黄芪寡糖药物的开发。

自身免疫性多内分泌腺病综合征Ⅱ型1例

自身免疫性多内分泌腺病综合征(autoimmune polyglandular syndrome,APS)是一种罕见病复杂病,是个体一生中同时或先后发生2种或2种以上自身免疫性内分泌腺病或非内分泌腺病的一组疾病群。广义上根据病因及临床特征,将其分为APS-Ⅰ型和APS-Ⅱ型。现报道APS-Ⅱ型1例。

黄芪多糖中抗炎组分的结构及其活性的初步研究

目的从黄芪中分离得到两种多糖,分别对两种多糖的化学结构和抗炎活性进行分析。方法采用水提醇沉法提取黄芪总多糖(Astragalus polysaccharides,APS),膜分离法得到两种多糖APS-Ⅰ和APS-Ⅱ。高效凝胶色谱法(HPGPC)测定APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的分子量,高效液相色谱法(HPLC-UV)测定两者的单糖组成,通过红外(IR)及甲基化分析对APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的结构进行表征。将巨噬细胞株RAW264.7培养于含不同浓度APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ的培养基,MTT法筛选合适的实验浓度,采用1μg/ml LPS诱导巨噬细胞株RAW264.7建立细胞炎症模型,应用不同浓度APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ处理被LPS诱导活化的巨噬细胞株RAW264.7,利用ELISA试剂盒测定各组细胞培养上清液一氧化碳(NO)、白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。结果APS由APS-Ⅰ(大于2000 kD)和APS-Ⅱ(10 kD)组成;两者均由鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)和半乳糖醛酸(GalA)5种单糖组成,APS-Ⅰ中Rha,Gal A,Glu,Gal,Ara的比例为0.1∶0.39∶17.2∶13.4∶1;在APS-Ⅱ中为0.14∶0.14∶24.04∶9.6∶1;红外光谱显示APS-Ⅰ以β型糖苷键为主;APS-Ⅱ同时包含α型糖苷键和β型糖苷键;甲基化分析显示两者单糖残基的主要连接方式不同,分别为:→4)-D-Glu-(1→,→6)-D-Gal-(1→,→4)-L-Ara-(1→和→4)-D-Glu-(1→,→3,5)-D-Glu-(1→,→3,4)-D-Gal-(1→。MTT实验表明APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ在0-100μg/ml质量浓度范围内无细胞毒性。与空白对照相比,1μg/ml LPS可显著上调巨噬细胞株RAW264.7中NO、TNF-α和IL-10的表达(P<0.05)。应用APS、APS-Ⅰ和APS-Ⅱ干预,可抑制促炎因子NO和TNF-α表达上调,促进抑炎因子IL-10表达上调(P<0.05),体外抗炎活性顺序为APS-Ⅰ>APS>APS-Ⅱ。结论APS-Ⅰ的体外抗炎活性优于APS-Ⅱ,可作为潜在的抗炎药物进行开发。