猪传染性胸膜肺炎疫苗抗原ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中的表达及发酵条件优化

猪胸膜肺炎放线杆菌是一种高度传染性、致死性呼吸道疾病,已造成养猪业严重损失。细胞毒素ApxⅡ是猪胸膜肺炎PCP(Porcine contagious pleuropneumonia)的主要抗原之一,可以作为猪胸膜肺炎疫苗的有效成分。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)具有无内毒素和较发达分泌系统的优点,是非常有潜力的重组细菌疫苗蛋白质表达系统。利用C.glutamicum表达系统生产ApxⅡ,实现其高效稳定表达,可为疫苗生产提供技术基础。前期研究已构建ApxⅡ分泌表达菌株,为进一步提高ApxⅡ的表达产量,通过在24孔板发酵优化,得到最优的培养基为CGXⅡ-YT,最优的表达温度为30℃,IPTG浓度为1.0 mmol/L,加入IPTG前培养6 h,发酵培养时间为24 h。进一步在摇瓶中放大发酵培养结果与24孔板发酵培养结果相同。最后在容积为5 L发酵罐中对ApxⅡ进行表达,与使用基础发酵培养基发酵相比,使用CGXⅡ-YT发酵培养基,且在优化后的发酵条件下ApxⅡ表达量明显提高,达到了114.60 mg/L。本研究实现了ApxⅡ在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达,为其进一步扩大化生产提供了基础。

白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基,推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示,与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达99%,该酶蛋白具有高度的进化保守性,其保守序列属于植物的POD超家族,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽,是一个亲水性蛋白,可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示,该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。

APX-115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果

目的:了解Nox抑制剂APX-115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果。方法:通过CCK8法检测H9c2细胞在不同浓度APX-115 free base预处理后的增殖活力;Western blot法和免疫荧光法检测Nox4蛋白的表达;并观察细胞形态的变化。结果:与Model组相比,APX-115 free base浓度为8μmol/L时,细胞增殖活力下降,其他浓度时,细胞增殖活力上升;APX-115 free base各处理组的Nox4蛋白表达均下调;APX-115 free base 5μmol/L处理组的细胞形态恢复梭形,细胞分布逐渐均匀,细胞间空隙减少,细胞数量基本恢复到正常水平。结论:5μmol/L时的APX-115 free base对高糖诱导下H9c2细胞的保护效果最佳。

盐地碱蓬(Suaedasalsa)APX基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。

琯溪蜜柚汁胞在发育与粒化过程中APX活性变化及同工酶分析

对不同发育时期的琯溪蜜柚(Citrus grandis‘Guanximiyou’)汁胞进行APX活性测定及同工酶分析。结果表明,随着汁胞的发育,APX活性增大;而柚子衰老腐烂时,APX活性迅速降低。APX同工酶随着汁胞发育而发生变化,花后150d的APX同工酶增加了1个组分(迁移率0.66),且随着汁胞的成熟,其表达量增加。花后230d时柚子开始衰老腐烂,花后242d已难以看到大部分APX同工酶酶谱。粒化汁胞的APX活性比正常汁胞大,同工酶酶谱亮度和清晰度也大,推测溪蜜柚汁胞在粒化过程中APX可清除活性氧自由基,抵抗氧化损伤。

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。

龙眼胚性愈伤组织维生素C过氧化物酶基因(apx)及NADH脱氢酶基因(nad2)部分序列的克隆

采用PCR技术从龙眼胚性愈伤组织中扩增出维生素C过氧化物酶基因 (apx)的部分cDNA序列longan1及NADH脱氢酶基因(nad2)的部分cDNA序列longan31,其中longan31是首次从体胚中克隆到的NADH脱氢酶基因(nad2).杂交结果显示,longan1与胚性愈伤组织和球形胚的RNA具有明显杂交信号,说明longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达. 图 3参

NaCl和等渗PEG对荞麦SOD及APX活性的影响

采用不同浓度NaC l和等渗PEG对2个荞麦品种进行处理,低浓度NaC l能明显促进2个荞麦品种根和叶的SOD及APX活性,等渗PEG处理时增加幅度较小;高盐度处理时苦荞根和叶的SOD及APX活性仍保持较高的水平,甜荞正相反,说明苦荞的耐胁迫性大于甜荞。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板,PCR方法扩增出apxⅢA基因3.1kb的片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apxⅢA基因进行比较,结果显示核苷酸同源性均在96%以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ/SalⅠ位点,成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中并获得表达。SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白分子量约为140Ku,与预测相符,Westernblot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的特点,建立了一种能够诊断猪传染性胸膜肺炎和进行免疫后效果评估的血清学方法ApxⅡ-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试,与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究,并用该试剂盒检测了来自中国、英国、丹麦、美国、加拿大和澳大利亚的临床猪血清1 453份。结果表明,ApxⅡ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性;3批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均<15%);试剂盒在2～8℃保存9个月,稳定性良好;ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎,同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法。

玉米APX基因的克隆及其原核表达研究

为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗盐性明显高于对照菌株BL21(pET28)且其抗NaCl的临界浓度为0.6 mol/L,这为后期对作物的抗逆研究提供了科学依据。

胸膜肺炎放线杆菌apxⅡCA基因的克隆、表达及ApxⅡ-ELISA检测方法的初步建立

根据国外已发表的胸膜肺炎放线杆菌 (APP) Apx 的基因序列设计了 1对引物 ,从我国 APP武汉株扩增出约3.5 kb的 apx CA基因。测序结果表明 ,该基因的大小与国外已报道的 1型和 9型 APP的 apx CA基因大小一致 ,同源性达 99%。将该基因连接到原核表达载体 p ET- 17b,构建了原核表达质粒 p ET- apx CA,并在大肠杆菌 BL 2 1(DE3)中表达出了大小约 10 5 0 0 0的 Apx 蛋白。提取包涵体蛋白作为抗原包被 EL ISA酶标板 ,对已知阳性、阴性血清和临床送检血清样品进行了 EL ISA检测 ,从而为最终建立 Apx - EL

转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)耐盐性

本研究以盐胁迫下逆境诱导型启动子SWPA2驱动转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯叶片一些生理指标的变化研究转基因甘薯耐盐性。结果表明:无胁迫时,转基因甘薯叶的生理指标与未转基因植株无明显差异。相同胁迫条件下,转基因甘薯叶的超氧化物歧化酶(SOD),抗坏血酸过氧化物酶(APX),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)活性均高于未转基因甘薯叶,尤以100mmol/LNaCl胁迫下差异最显著;转基因植株的根长也大于未转基因植株;转基因植株的叶绿素下降幅度和MDA含量则低于未转基因植株。这说明转基因甘薯具有一定的耐盐性。因此开发种植转基因耐盐甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机有重大的意义。

低温下冬小麦SOD及APX酶相关基因的表达分析

为进一步揭示寒地冬小麦抗寒的生理机制,以抗寒性差异较大的"东农冬麦1号"和"中国春"为材料,测定不同低温冷冻条件下小麦超氧化物歧化酶(SOD)相关基因TSOD-1、TSOD-2、TSOD-3以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)相关基因HAPX-1、HAPX-2、HAPX-3的表达差异。结果表明,TSOD-1、TSOD-2、TSOD-3、HAPX-2和HAPX-3基因在特定低温条件下于东农冬麦1号中的表达量明显高于中国春,而HAPX-1基因在东农冬麦1号中的表达量几乎均低于中国春。其中,TSOD-3基因在冻处理初期(低温驯化30d及-10℃2h)于东农冬麦1号中的表达量相对于中国春达到最大,分别是中国春中的8.63和11.78倍;HAPX-2和HAPX-3基因均在冷冻期(-12℃2h)于东农冬麦1号中的表达量相对于中国春达到最大,分别是中国春中的3.12和21.22倍。因此,初步推断TSOD-3、HAPX-2和HAPX-3基因是参与低温响应的重要基因。其中,TSOD-3基因在冷胁迫初期起主要作用,HAPX-2和HAPX-3基因在持续冷冻下起主要作用。

转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣抗旱相关生理特性

在获得转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣株系的基础上,对3个转基因株系的抗旱相关生理特性进行分析。结果表明:正常供水条件下,转基因株系与非转基因植株各项生理指标差异不显著;干旱条件下,3个转基因株系菊苣叶片APX质量摩尔浓度均显著高于非转基因对照。3个转基因株系中有2个株系丙二醛(MDA)质量摩尔浓度低于非转基因对照,表明APX基因可显著提高菊苣APX活性,降低氧自由基浓度,减轻对细胞的伤害。3个转基因株系叶片相对含水量、脯氨酸质量分数、叶绿素质量分数、单株幼苗的根系生长量,均高于非转基因对照。可见,转APX基因菊苣具有较强的抗旱能力,从而验证APX基因的抗旱功能,为转基因材料应用于菊苣的抗旱育种提供依据。

低温胁迫对茄子幼苗APX活性的影响及cDNA序列克隆研究

[目的]探讨低温胁迫对茄子基因表达的影响。[方法]以三叶期茄子幼苗为材料,于(8±1)℃的低温下胁迫24、48、72、961、20 h,取茄子第2片叶测定APX活性及进行APX基因的cDNA克隆。[结果]结果表明:低温胁迫下APX活性先上升后下降,以胁迫处理72 h时酶活性最高;APX基因的cDNA序列测序结果显示该序列与烟草(Nicotiana tabacum L.)、菠菜(Spinacia oleracea L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、番茄(Lycopersicon esculentum L.)、长豇豆(Vigna unguiculata L.)、龙眼(Dimocarpus longan L.)等具有较高的同源性。[结论]APX在进化中具有较高的保守性。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ^-/Amp^r突变株的构建

根据已发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清5型核苷酸序列设计并合成了一对引物,从自行分离的APP菌株PCR扩增apxⅡCA基因,将该片段与pBluescriptSK(+)载体连接,得到质粒pSK CA。另外,从质粒pIC neo中得到的Ampr基因经XbaⅠ酶切消化后,克隆到pSK CA中的XbaⅠ位点,获得了重组转移质粒pSK CAmpr。pSK CAmprDNA通过电转化导入亲本菌,电转化后的产物涂布于TM平板,可获得突变株。提取突变株和亲本菌基因组DNA,用PCR检测含有apxⅡC基因的胸膜肺炎放线杆菌染色体区域。从突变株基因组DNA扩增得到的一条PCRDNA片段比从亲本菌基因组DNA扩增得到的一条DNA片段大1 3kb,增大的片段与所插入的Ampr基因大小相符合。用合成的Ampr基因引物从突变株基因组DNA中也能扩增到一条1 3kb的特异性DNA片段。同时South ernblot鉴定有特异性带。这表明我们所构建的突变株是成功的。测定了突变株的遗传稳定性及突变株对动物的安全性,为进一步研究用其它报告基因置换Ampr基因后,研制单基因工程疫苗及以APP毒力缺失突变菌株为载体,表达外源基因的APP基因工程菌的研究奠定了坚实的基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达

参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5 型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物,用PCR法扩增apxⅠA基因,获得了3 069 bp的片段,将其克隆到pMD 18 T载体,经酶切、PCR鉴定和序列分析,表明克隆是成功的。再将长为1 149 bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N 端的片段)插入到原核表达载体pET 28(a)中,构建了重组表达质粒pET apxⅠA,转化大肠埃希氏菌JM109(DE3),在IPTG 诱导下获得了高效表达,经SDS PAGE检测,证实表达产物大小约为41 ku。