白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基,推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示,与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达99%,该酶蛋白具有高度的进化保守性,其保守序列属于植物的POD超家族,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽,是一个亲水性蛋白,可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示,该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。

白桦抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及表达分析

从白桦(Betula platyphylla Suk.)cDNA文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长1049bp,其ORF全长750bp,编码250个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为27712.7,理论等电点6.08,保守区分析确定其含有APX蛋白保守序列,属于植物POD超家族。利用实时定量RT-PCR进一步分析白桦苗木在0.8%NaCl胁迫处理下不同时间点APX基因的表达情况。结果表明,盐胁迫处理诱导了APX基因在白桦叶片中的表达,说明APX基因与植物抗盐相关。

转逆境诱导型启动子SWPA2驱动Cu/ZnSOD和APX基因甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)耐盐性

本研究以盐胁迫下逆境诱导型启动子SWPA2驱动转Cu/Zn SOD和APX基因甘薯叶片一些生理指标的变化研究转基因甘薯耐盐性。结果表明:无胁迫时,转基因甘薯叶的生理指标与未转基因植株无明显差异。相同胁迫条件下,转基因甘薯叶的超氧化物歧化酶(SOD),抗坏血酸过氧化物酶(APX),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)活性均高于未转基因甘薯叶,尤以100mmol/LNaCl胁迫下差异最显著;转基因植株的根长也大于未转基因植株;转基因植株的叶绿素下降幅度和MDA含量则低于未转基因植株。这说明转基因甘薯具有一定的耐盐性。因此开发种植转基因耐盐甘薯对有效利用盐渍化土地和缓解能源危机有重大的意义。

茶树品种及萎凋过程中叶片APX基因表达的qPCR分析

应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)的方法对不同茶树品种及萎凋过程中抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的表达进行定量分析.结果表明:茶树不同品种APX基因的表达量存在显著差异,相对表达量变化范围为0.65-5.69,6个茶树品种APX基因的相对表达量从大到小依次为毛蟹、福云6号、肉桂、福鼎大白茶、黄旦、铁观音;茶叶APX基因的表达明显受到萎凋工艺的影响,在茶叶萎凋过程中APX基因的表达量呈现"升高—降低—再升高—再降低"的趋势,相对表达量变化范围为0.02-7.46.

转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣抗旱相关生理特性

在获得转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣株系的基础上,对3个转基因株系的抗旱相关生理特性进行分析。结果表明:正常供水条件下,转基因株系与非转基因植株各项生理指标差异不显著;干旱条件下,3个转基因株系菊苣叶片APX质量摩尔浓度均显著高于非转基因对照。3个转基因株系中有2个株系丙二醛(MDA)质量摩尔浓度低于非转基因对照,表明APX基因可显著提高菊苣APX活性,降低氧自由基浓度,减轻对细胞的伤害。3个转基因株系叶片相对含水量、脯氨酸质量分数、叶绿素质量分数、单株幼苗的根系生长量,均高于非转基因对照。可见,转APX基因菊苣具有较强的抗旱能力,从而验证APX基因的抗旱功能,为转基因材料应用于菊苣的抗旱育种提供依据。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板,PCR方法扩增出apxⅢA基因3.1kb的片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apxⅢA基因进行比较,结果显示核苷酸同源性均在96%以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ/SalⅠ位点,成功构建了重组表达载体pGEX-apxⅢA,转化大肠杆菌BL-21(DE3)中并获得表达。SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白分子量约为140Ku,与预测相符,Westernblot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。

外源SOD和APX基因在转基因烟草中的表达与遗传

分析转超氧化物歧化酶基因(SOD)或抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)烟草及其自交和杂交后代的叶片中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的结果表明:转基因烟草的SOD和POD活性在终花期最强,不同叶位叶中SOD活性差异不明显,POD活性以下部叶为最高;转基因烟草的SOD或POD活性显著高于近等基因的非转基因品系。杂交后代(F1、F2)的SOD活性能保持稳定,略高于亲本;自交后代(S1～S3)与自交亲本的SOD和POD活性相当。

胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apxⅠA基因片段,分别构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA。对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%。利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apxⅠA分别进行表达。结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白。证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达。

番茄APX基因的分离及表达分析

植物体内代谢的不平衡会导致活性氧的大量积累,若未及时清除,细胞将受到严重的氧化伤害。在抗氧化系统中,抗坏血酸过氧化物酶是其中的关键酶,对于保护细胞组分免受活性氧的破坏是至关重要的。本研究利用RTPCR方法从番茄中克隆得到抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为LeAPX,序列全长1 412bp,开放阅读框1 266bp,编码421个氨基酸。系统发育树比对表明,LeAPX氨基酸序列与马铃薯、胡麻、烟草的APX序列同源性较高。氨基酸序列分析表明番茄APX和其它植物一样,含有两个保守的功能域。对其启动子序列分析显示,该片段富含HSE、LTR、GT1等响应胁迫的顺式作用元件。定量分析表明,LetAPX基因在叶片中的表达量最高。

菘蓝APX基因克隆及序列分析

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体。从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序。结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致。说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究。

葡萄APX基因家族的鉴定与表达分析

【目的】当植物遭受土壤盐碱、干旱和低温等非生物逆境胁迫时,其体内产生大量活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),影响植物正常生长发育甚至死亡。抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)能够有效清除逆境胁迫下产生的ROS,从而保护植物免受损害。本研究旨在葡萄全基因组中鉴定出APX基因家族成员,并探究其在非生物胁迫下的表达情况,为后续葡萄抗逆基因的挖掘和功能研究提供理论依据。【方法】以生长30 d的葡萄‘黑比诺’试管苗为材料,通过生物信息学方法分析该基因家族的理化性质、系统进化、启动子顺式作用元件分布、基因芯片表达情况,利用qRT-PCR分析该基因家族成员在不同逆境胁迫下表达情况。【结果】葡萄APX基因家族具有7个成员,其氨基酸数目分布在104~421,等电点(Isoelectric Point,pI)介于5.75~8.77。系统进化分析发现,葡萄VvAPX与水稻OsAPX同源性较高,拟南芥AtAPX次之。蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。亚细胞定位预测发现,VvAPX基因在叶绿体、线粒体和细胞质中表达较高。VvAPXs基因均含有A活性位点、H结合位点以及motif1保守基序。顺式作用元件分析结果发现,VvAPXs基因家族所有成员中均含有干旱胁迫应答元件(MYB)和抗旱元件识别位点(MYC)。基因芯片表达图谱显示,在高盐、PEG、低温处理条件下,与CK3相比7个基因均上调表达,其中VvAPX04较明显。qRT-PCR结果表明,VvAPX04在200 mmol·L-1NaCl处理下与对照相比显著性上调,是对照的14.5倍,在10%PEG处理下的表达量是对照的1.5倍。VvAPX05在10%PEG处理下与对照相比显著性上调,是对照的1.5倍。【结论】初步鉴定并提供了葡萄APX基因家族成员信息,预测了所具有的部分功能,为进一步研究葡萄APX基因参与非生物逆境胁迫的机制提供参考。

几种芸薹属作物APX家族基因的鉴定与序列分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是植物体叶绿体清除H2O2的关键酶。为了探究芸薹属作物中APX家族基因的序列特点和表达模式,本研究利用生物信息学方法,从大白菜、甘蓝和欧洲油菜中分别鉴定出10、9和22条APX家族基因,对这41个成员序列特点、染色体分布、CDS保守域、蛋白保守结构域、蛋白三级结构和系统进化关系等进行预测分析,并通过基因表达数据库分析这些基因在高温、干旱和生物胁迫等逆境条件下的表达模式。结果表明,APX在进化树上可分为8个亚族,分散在不同的染色体上;这些APX基因拥有相对稳定的CDS保守结构域、蛋白保守结构域和三级结构,都具有过氧化物酶功能域,在peroxidase功能域的后端均含有一个螺旋结构状的保守域Motif6。APX基因的Ka/Ks值均小于1,表明APX家族基因整体上正在经历纯化选择。大部分APX1和APX2基因在受到高温胁迫时表达上调,其中BrAPX2a在大白菜的胚和胚乳中强烈响应高温胁迫,但在大白菜其他部位表达微弱,存在一定的表达组织特异性。APX3、APX4等基因对干旱和高温胁迫响应不明显;甘蓝3个APX1基因在白粉虱为害胁迫时表达上调。本研究结果为芸薹属作物APX家族成员的克隆、表达与功能研究提供了一定参考。

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C1417H2246N394O423S5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。

酸雨胁迫对尾叶桉抗逆生理及APX-类基因转录水平的影响

以尾叶桉(Eucalyptus urophylla)1月龄树苗为材料,用不同pH值(5.6、4.0、2.5、2.0)的模拟酸雨连续喷雾灌根处理15 d,检测净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间二氧化碳摩尔分数、水分利用效率、叶绿素质量分数、丙二醛质量摩尔浓度、电导率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性等生理指标及抗坏血酸过氧化物酶类基因(APX)的转录变化。酸雨处理后,叶绿素质量分数无明显变化,净光合速率、蒸腾速率、水分利用效率下降,丙二醛质量摩尔浓度、电导率显著升高,SOD活性、POD活性、CAT活性都明显升高,均在pH值为2.0有最大值,pH=2.0时,7个APX-类基因的转录水平分别为对照的1.76、2.65、3.68、7.34、0.58、1.82、1.46倍。结果表明,酸雨会抑制尾叶桉的光合作用,引起活性氧(ROS)代谢失衡,导致膜脂过氧化,且酸雨强度越大其作用越明显;SOD活性、POD活性、CAT活性增强,APX-类基因表达上调是尾叶桉应对酸雨胁迫的保护机制;抗逆生理和APX-类基因的转录水平存在对应关系。

毛竹APX基因系统进化与表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(aseorbate peroxidase,APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一,尤其是叶绿体中清除H_(2)O_(2)的关键酶,也是维生素C代谢的主要酶类。该文基于生物信息学方法,利用毛竹的基因组及转录组数据鉴定毛竹中的APX基因家族成员,并对其编码的蛋白基本理化性质、基因结构、启动子元件、系统进化及共线性关系、重复串联基因、GO注释及表达模式进行综合分析,共鉴定出21种编码APX的基因。结果表明:(1)PeAPX基因家族成员多为不稳定疏水蛋白,基因结构、基序及结构域相对较为保守,大多数APX基因具有高度保守的内含子模式。(2)系统进化关系显示毛竹APX基因与水稻APX基因有着较高的同源性关系,PeAPX具有较高的进化保守性。(3)Ka/Ks分析表明PeAPX基因都经历了纯化选择压力,此外在每个APX基因的启动子序列中发现有许多与应激反应和植物激素相关的顺式作用元件,结合表达量分析,表明毛竹APX基因在毛竹生长发育中起着正向促进作用。该研究为进一步了解毛竹APX基因家族基本功能及其抗氧化机制提供了一定的参考,为毛竹APX基因功能的深层次鉴定提供了重要依据。

猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株分离鉴定及生物学特性研究

新疆南疆某规模猪场发生疑似猪传染性胸膜肺炎,为确定其病原,对采集的发病猪肺脏样品进行了细菌分离、生化试验、PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等。结果表明,从该规模养猪场分离获得1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,经生物学特性分析、PCR检测鉴定为APP生物Ⅰ型、血清型1型。致病性试验结果显示该分离株对小鼠具有致病性,药敏试验显示该菌株对环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物具有敏感性。经耐药基因检测分析,该病原为携带floR耐药基因的血清型1型猪胸膜肺炎放线杆菌。

陆地棉抗坏血酸过氧化物酶基因家族全基因组生物信息学分析

【目的】抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是过氧化物酶家族中的1类成员,可以清除活性氧。APX家族的生物信息学分析有助于更好地了解该家族基因。【方法】利用生物信息学方法,从中国农业科学院棉花研究所提供的陆地棉序列中鉴定出14条APX基因家族序列,并对这14个成员的染色体定位、亚细胞定位、进化关系、理化性质、信号肽、保守基序以及其编码蛋白的结构特征进行了预测分析,并初步分析了部分基因的表达。【结果】APX基因分布广泛,分散在不同的染色体上;且大部分APX蛋白定位在细胞质,是亲水性脂溶蛋白;有3个保守基序,保守性较强;基因起源和进化比较复杂;二级结构的主要元件为α-螺旋和无规则卷曲。根据表达分析推测,第1亚组和第2亚组的基因在棉纤维发育的不同时期起作用。【结论】这些结果有望为APX家族成员的结构与功能挖掘提供参考。

转铜/锌超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶基因甘薯的耐旱性

水分胁迫使转铜/锌超氧化物歧化酶基因(Cu/ZnSOD)和抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)甘薯及未转基因甘薯中超氧阴离子(O-2·)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)含量和细胞膜相对透性增加,在相同条件下以上指标均为转基因甘薯低于未转基因甘薯;而叶片含水量、净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)均下降,SOD和APX酶活性随胁迫程度的加重先增大后减小,胞间CO2浓度(Ci)则先减小后增大,在相同条件下转基因甘薯中以上指标均高于未转基因甘薯。这些结果表明:转入Cu/ZnSOD和APX基因使转基因甘薯清除活性氧的能力增强,在水分胁迫下能保持较高的叶片含水量和Pn,耐旱性得到提高。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的PCR鉴定

据胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)生物I型各血清型之间外毒素(apx)基因组结构差异,参考GenBank上已发表的4种毒素(apxI/apxII/apxIII/apxIV)的核酸序列设计了6对特异性引物,对APP的12个血清型进行多重PCR扩增,得出不同的特异性的扩增片段,得以准确鉴定APP生物I型中的9种血清型,但其中血清型2和8,血清型5、9和11仍未能区分。

高粱抗坏血酸过氧化物酶基因的电子克隆及序列分析

利用高粱EST数据库及电子克隆等技术克隆了高粱APX基因,其开放阅读框大小为753bp,编码250个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为27.1kDa,等电点约为5.135。它与C4植物玉米的胞质APX(ACG41151)在进化上的距离最短,亲缘关系最近。高粱APX无信号肽,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中。第33-44氨基酸片段为其过氧化物酶活性区域,第155-165氨基酸片段则是其与亚铁血红素配基结合的区域。预测的二级结构及三级结构都表明高粱APX含有较多的不规则卷曲和α螺旋,三级结构上呈椭球体。