猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的细菌性呼吸道传染病。Apx毒素(actinbacillus pleuropneumoniae toxin)是由胸膜肺炎放线杆菌分泌的一类溶血毒素,在胸膜肺炎放线杆菌致病过程中,Apx毒素起了重要的作用。

胸膜肺炎放线杆菌在不同培养基中生长、生物膜形成及Apx毒素分泌能力的差异研究

为比较胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型~12型菌株在不同培养基中的生长、生物膜形成以及Apx毒素分泌能力的差异,选用5种细菌培养基BHI、LB、MHB、PPLO和TSB,首先测定APP不同血清型菌株在5种培养基中的生长曲线,进而测定不同血清型菌株在5种培养基中的生物膜形成能力,同时测定这些菌株对20种抗菌药物的耐药性,最后测定APP血清1型菌株在5种培养基中添加CaCl_(2)对ApxⅠ毒素分泌的影响。结果显示,APP不同血清型菌株在BHI和TSB中生长较好,而在MHB、LB和PPLO生长较差;在不同培养基中培养24 h生物膜形成能力为MHB>BHI>TSB>LB>PPLO,血清3、4、7型和12型参考菌株生物膜形成能力较强;药敏结果显示,APP不同血清型菌株仅对万古霉素耐药;Apx毒素分泌结果显示,ApxⅠ在MHB、LB和PPLO中表达量显著高于BHI和TSB,而且培养基中添加5 mmol/L CaCl_(2)后ApxⅠ分泌量显著增加。研究结果可为分析APP不同血清型菌株在不同培养基中的生物学特性以及疫苗研制提供参考。

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx毒素的分子生物学与致病机理

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（App）引起的猪的一种呼吸道传染病。到目前为止,APP已经被分离鉴定出了15种血清型（1~15）。15种血清型的APP能产生属于RTX毒素家族的4种Apx毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。ApxⅠ操纵子包含有ApxⅠC、A、B、D 4个基因;ApxⅠ毒素含有13个富含甘氨酸的重复区。ApxⅡ操纵子仅包括结构基因ApxⅡA和激活基因ApxⅡC,而无分泌基因;ApxⅡ蛋白含有8个甘氨酸的序列重复。ApxⅢ操纵子与ApxⅠ操纵子相同,具有一个完整的操纵子;ApxⅢ在N-末端有3个疏水区,在C末端部分有13个富含甘氨酸的区域。Apx毒素的致病机理为先由没有活性的前体蛋白转变为有活性的ApxA蛋白,再由有活性的ApxA蛋白侵害细胞。

突变缺失Apx毒素分泌蛋白基因apxⅢB和apxⅢD的胸膜肺炎放线杆菌血清2型的构建与鉴定

经鉴定,Apx毒素是猪胸膜肺炎的病原体—胸膜肺炎放线杆菌的重要毒力因子。在一些胸膜肺炎放线杆菌血清型中,Apx毒素是由apxⅢB和apxⅢD编码后经细胞膜分泌的。为了构建1株抗胸膜肺炎放线杆菌的活疫苗株,笔者将胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株-1536的apxⅢB和apxⅢD基因进行灭活,从而构建DeltaapxⅢB/DapxⅢD突变株(1536DeltaBDeltaD)。用活的1536DeltaBDeltaD胸膜肺炎放线杆菌对猪进行免疫后,能保护猪免于同源的野生型胸膜肺炎放线杆菌1536的攻击。因此,被损坏的Apx毒素分泌物可使胸膜肺炎放线杆菌的毒力减弱,并可作为开发胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的有效策略。

胸膜肺炎放线杆菌ApxII毒素结构基因的原核表达以及重组蛋白的免疫原性分析

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的一种呼吸道疾病。本实验以APP血清7型的一株现地分离株L25-4株为研究对象,对其分泌的ApxⅡ毒素的结构基因apxⅡA进行了全基因克隆和测序,并利用原核表达载体pGEX-6P-1在E.coli中进行了原核表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体蛋白经过洗涤后作为抗原用于Western-blotting免疫印迹实验,结果表明重组的ApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性。

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用

据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究

将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMCaCl2的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化ApxⅠ。将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察。将纯化的ApxⅠ与弗氏佐剂按1：1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量。根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒。结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2～103.5mg/kg;ApxⅠ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果。

胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素抗原优势决定簇的筛选和融合表达

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法,本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ~Ⅲ)生物学信息分析的基础上,以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ~Ⅲ分段扩增后进行截短表达,获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析,确定ApxⅠ~Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列,无缝克隆3个蛋白片段基因,通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。

胸膜肺炎放线杆菌Apxll毒素的基因序列特征

为了深入地了解胸膜肺炎放线杆菌(APP)分泌的ApxⅡ毒素的分子结构及序列特征,本实验以一株APP 7型现地分离株L25-4株为实验材料,对其分泌的ApXⅡ毒素的结构基因apxⅡA及其上游启动子区进行了PCR扩增和测序。结果表明APP7型L25-4株apxⅡA基因与其它血清型apxⅡA基因核苷酸序列同源性达99．5%以上,氨基酸序列同源性达98．5%以上。在ApxⅡA蛋白的N末端有3个大的疏水结构域,分布在240～422位氨基酸之间。在ApxⅡA蛋白的C末端有富含甘氨酸(Gly)和天门冬氨酸(Asp)的九肽(nonapeptides)重复序列Leu/Ile/Phe-Xaa-Gly-Gly-Xaa-Gly-Asm/Ssp-Asp-Xaa,串连重复9次。这些结构域的起始氨基酸的位置分别为374、503、630、735、753、762、771、780和802。推定的赖氨酸酰基化作用位点为557位氨基酸,与E．coli的HlyA相比,在688位氨基酸处少了一个赖氨酸酰基化作用位点。apxⅡA基因启动子-10区序列为AATAAT,-35区序列为TTAAT,-10区与-35区间隔序列为11个碱基。

猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株的分离鉴定及ApxⅣA基因的克隆与序列分析

从新疆北疆4个规模化猪场的20份发病猪病料中分离到1株细菌。经形态染色镜检、培养特性、生化特性和部分生物学特性试验鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。根据猪胸膜肺炎放线杆菌ⅣA毒素基因特异性引物进行PCR扩增,得到1条与预期大小一致的2427bp的条带,将PCR产物纯化后克隆至pMD19-T载体上并测序。结果表明,该片段的碱基序列与GenBank中参考序列的同源性为98%,并与三株标准株比较,同源性分别为98.23%、99.46%和98.06%。

检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体乳胶凝集试验方法的建立

采用Ni-NTA His.Bind方法纯化pET-28a-ApxⅣ2表达蛋白,以羧化乳胶为载体,经化学交联法致敏乳胶,对致敏条件优化后进行质量检测。结果显示,在pH 4.7的PBS缓冲液中,乳胶浓度为2%、蛋白质量浓度为1.5g/L,偶联8h后制备的致敏乳胶凝集反应最好,致敏乳胶抗原无自凝现象;与副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌阳性血清不发生凝集;批内重复、批间重复试验很稳定;阳性血清敏感性可达1∶32。对比试验中与ELISA方法的符合率为80%,2种方法检测的结果基本相符。结果表明,试验初步建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的乳胶凝集方法,为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支撑。