AQP4在高血压脑出血周围水肿组织中表达的临床研究

目的研究水通道蛋白-4(AQP4)与高血压脑出血(HICH)患者血肿周围组织水肿的相关性,并观察其在脑水肿形成过程中表达变化的规律。方法对32例HICH患者行开颅血肿清除术,对术中所取得的血肿周围水肿脑组织标本(实验组)分别应用免疫组化方法测定AQP4的表达,并与对照组(为手术入路中皮层造瘘所获取的皮层标本)进行对比分析。结果实验组各时间段血肿周围水肿脑组织AQP4的表达均明显高于对照组(P<0.01);脑出血后24h周围水肿脑组织中的AQP4含量显著升高,直到72h仍在较高水平。结论HICH血肿周围脑水肿的形成和发展与AQP4的异常表达密切相关。

AQP4与PKC在大鼠CIR后脑水肿模型中的变化及作用

目的通过研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后水通道蛋白4（AQP4）、蛋白激酶C（PKC）表达水平的变化,来探讨两者与脑水肿之间的关系。方法通过线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血（MCAO）再灌注模型,动物随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、缺血再灌注组（CIR）。参照Garcia JH法进行神经功能缺损评分、用Elliot法检测脑组织含水量、免疫组化法检测AQP4及PKC的表达。结果 CIR后6h即有神经功能缺损,脑含水量在CIR12h明显升高,1~3d时达到高峰;AQP4表达在早期水平降低,从12h逐渐升高,至CIR 24h明显升高,3d达高峰;PKC在CIR后6h开始持续性升高,至第5d仍保持较高水平。结论早期的细胞源性脑水肿可能和PKC的升高有关,后期的血管源性脑水肿可能和AQP4的升高相关。

星形胶质细胞AQP4蛋白在缺氧/复氧条件下表达变化的研究

目的观察缺氧/复氧条件下星形胶质细胞形态和AQP4蛋白的表达变化以及葛根素对其表达变化的影响,探讨脑缺血再灌注损伤与AQP4的关系以及葛根素的干预作用。方法原代培养星形胶质细胞,用5%CO2+95%N2混合气体造成缺氧,以LDH漏出率及MTT降解率作为细胞受损指标,应用Western blot技术检验星形胶质细胞缺氧/复氧各个时间点AQP4蛋白的表达变化及葛根素的干预效果。结果体外培养的星形胶质细胞在缺氧环境下损伤不明显,随着复氧时间的延长细胞损害加重。AQP4蛋白在缺氧时表达与正常对照组无明显差异,复氧后表达升高并随时间延长呈增高趋势(P<0.05)。葛根素干预组AQP4蛋白表达丰度与缺氧/复氧组无明显差异(P>0.05)。结论星形胶质细胞AQP4蛋白表达变化与细胞损伤有明显相关性,葛根素对星形胶质细胞损伤的保护作用不是通过改变AQP4的表达来实现的。

续命汤对局灶性脑缺血中风大鼠紧密连接相关蛋白(Zo-1)和水通道蛋白4 (AQP4) mRNA表达的影响

目的:观察续命汤对局灶性脑缺血中风大鼠紧密连接相关蛋白(Zo-1)和水通道蛋白4(AQP4)mRNA表达的影响。方法:将清洁级SD大鼠分为分假手术组、模型组、尼莫地平组、续命汤低剂量组、中剂量组、高剂量组6组,通过栓线法制备局灶性脑缺血中风大鼠模型,观察并记录SD大鼠造模后神经功能评分、免疫组化法检测脑缺血大鼠脑组织紧密连接相关蛋白(Zo-1)和水通道蛋白4(AQP4)mRNA表达。结果:造模后大鼠神经行为学评分显著升高,Zo-1蛋白阳性表达降低,AQP4 mRNA的表达增加,续命汤各治疗组能拮抗以上作用,以续命汤中、高剂量组为显著,其疗效优于或与尼莫地平组相当。结论:续命汤能减少Zo-1蛋白的损失,维持紧密连接复合体结构的完整性,抑制AQP4 mRNA的过度释放与表达,减轻脑缺血和水肿,进而实现保护血脑屏障的作用。

miR-331-5p靶向AQP4对大鼠星形胶质细胞中DEACMP标志物表达的影响

目的探讨一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)标志物表达的潜在机制。方法纳入2018年7月至2020年7月于我院接受治疗的DEACMP患者36例,健康体检者32例,检测其血清中DEACMP标志物髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达水平。给大鼠腹膜内注射CO以建造大鼠DECAMP模型。造模成功的为DECAMP组大鼠,相应PBS处理的为对照组大鼠。水迷宫测试两组大鼠逃脱时间。苏木精伊红染色分析两组大鼠海马结构。高通量测序检测两组大鼠星形胶质细胞中的差异miRNA。过表达差异miRNA后,检测大鼠星形胶质细胞中DEACMP标志物MBP的表达水平。通过miRDB在线分析miRNA的潜在底物并通过荧光素酶报告实验验证。结果与健康体检者相比,DECAMP患者血清中MBP的表达水平升高(P<0.05)。DEACMP组中毒大鼠在第7天和第14天的逃脱时间比正常大鼠要长(P<0.05)。对照组海马的结构和细胞形状是正常的,而在DEACMP组中观察到神经元损伤,例如细胞萎缩,核固体收缩和结构模糊。与对照组相比,大鼠血清DEACMP标志物MBP的蛋白水平在第7天和第14天均上升(P<0.05)。过表达miR-331-5p时大鼠星形胶质细胞的MBP表达水平上升(P<0.05)。敲低miR-331-5p后,大鼠星形胶质细胞的MBP表达水平下降(P<0.05)。敲低AQP4时大鼠星形胶质细胞的MBP表达水平上升(P<0.05)。过表达AQP4后,大鼠星形胶质细胞的MBP表达水平下降(P<0.05)。过表达miR-331-5p后,AQP4的蛋白水平下降(P<0.05)。敲低miR-331-5p后,AQP4的蛋白水平上升(P<0.05)。miR-331-5p靶向AQP4的3端非编码区(P<0.05)。DEACMP模型中毒大鼠海马在AQP4上的阳性染色少于正常大鼠。结论miR-331-5p通过靶向AQP4mRNA的3端非编码区,减少了AQP4的蛋白表达水平,最终增加了大鼠星形胶质细胞中DEACMP标志物MBP的表达。

补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞对脑缺血大鼠血脑屏障通透性的影响

目的:为了研究补阳还五汤联合骨髓间充质干细胞(MSCs)对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障(blood brain barrier, BBB)通透性及其影响因素AQP4的表达。方法:将大鼠80只随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、MSCs组、补阳还五汤联合MSCs组(联合组),每组各16只。利用改良线栓法制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery obstruction,MCAO)缺血再灌注大鼠模型,在3、5 d运用干湿重法测定缺血脑组织含水量,采用伊文思蓝(Evans blue, EB)法检测血脑屏障的通透性,用透射电镜观察血脑屏障超微结构的变化,采用Western Blot法检测缺血脑组织中AQP4的表达。结果:与假手术组相比,在造模后3、5 d时间点,MCAO模型组大鼠脑组织含水量、EB含量显著升高,AQP4的蛋白表达水平上升,具有极显著性统计学意义(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤组、MSCs组、联合组中缺血脑组织含水量、EB含量及AQP4的蛋白表达水平显著下降,各组间有显著统计学意义(P<0.05)。联合组的作用在第5天更为明显,与MSCs组及补阳还五汤组相比,具有显著性差异(P<0.05)。结论:补阳还五汤联合MSCs可以降低脑组织的含水量及血脑屏障的通透性,维持BBB结构的完整性,其作用机制与水通道蛋白AQP4的调控密切相关。

胱抑素C对缺血再灌注损伤大鼠脑水肿和微血管的影响

目的观察胱抑素C(Cys C)干预对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质AQP4、MMP-2和血脑屏障的形态学变化并探讨其影响机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和Cys C低、中、高浓度组。采用改良线拴法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,缺血2 h再灌注24 h后采用干湿重法测定脑组织含水量、检测脑组织EB含量,评价血脑屏障通透性改变程度。在电镜下观察各组大鼠脑皮质微血管的形态结构;Western blot法检测水AQP4表达,免疫组化法进行MMP-2光密度值检测。结果与缺血再灌注组比较,Cys C低、中浓度组血脑屏障损伤程度明显减轻,毛细血管张开数量增多;AQP4蛋白表达降低,MMP-2表达的OD值也显著减少。而Cys C高浓度组血脑屏障损伤严重;AQP4蛋白表达明显升高,MMP-2蛋白表达OD值也明显增大。结论Cys C在一定浓度下干预能减轻缺血再灌注对血脑屏障的损伤,其机制可能与AQP4蛋白表达降低及MMP-2表达OD值减少有一定的关系。

TGN-020对大鼠脊髓损伤后继发性水肿和星形胶质细胞增生的影响

目的检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)特异性抑制剂TGN-020对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后继发性水肿和星形胶质细胞增生相关指标的影响,为SCI后水肿与星形细胞增生之间的关系研究提供重要依据。方法成年雌性SD大鼠72只,体质量180~220g,随机分为假手术组(Sham组)、单纯脊髓损伤组(SCI组)、TGN-020干预组(TGN-020组),每组24只。采用改良后的动脉夹挤压脊髓建立SCI模型,Sham组仅行椎板切除术。术后TGN-020组腹腔内注射TGN-020(5mg/kg,ip)处理,Sham组和SCI组予以等体积的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)各组于术后3d收集标本,分别采用干湿重法检测含水量变化,采用蛋白印记、免疫荧光检测AQP4、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达。结果术后3d,与Sham组相比,SCI组和TGN-020组脊髓损伤区含水量明显升高(P<0.01),与SCI组相比,TGN-020组脊髓损伤区含水量减少(P<0.05);SCI组和TGN-020组AQP4、GFAP、PCNA的表达较Sham组明显升高(P<0.01),TGN-020组AQP4、GFAP、PCNA的表达较SCI组降低(P<0.05)。结论 TGN-020可以通过下调大鼠脊髓损伤后AQP4的表达减轻继发性水肿,抑制星形胶质细胞增生,从而促进大鼠急性损伤后的功能恢复。

水通道蛋白4基因敲除对神经病理性疼痛的影响及可能机制研究

目的研究水通道蛋白4(AQP4)在神经病理性疼痛中的作用,并探讨其与脊髓星形胶质细胞激活和促炎细胞因子释放的关系。方法应用AQP4基因敲除(KO)和野生型(WT)小鼠建立坐骨神经分支损伤模型(SNI),观察AQP4基因敲除对疼痛行为的影响,随后采用Western印迹法(WB)检测SNI模型小鼠脊髓中星形胶质细胞激活相关标志物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化,采用ELISA法检测SNI模型小鼠脊髓中促炎细胞因子(TNF-α、IL-6)含量的变化。结果 SNI手术后,与WT组相比,KO组小鼠的机械刺激痛觉超敏程度显著降低(P<0.01),而经假手术(Sham)处理的WT与KO组小鼠无差异(P>0.05),提示AQP4基因敲除可减轻神经病理性疼痛。WB结果显示,后术14 d,与WT-Sham组相比,WT-SNI组小鼠脊髓GFAP含量显著高升高(P<0.01);与WTSNI组相比,KO-SNI组小鼠脊髓GFAP含量显著降低(P<0.01),提示AQP4基因敲除抑制了小鼠SNI模型脊髓星形胶质细胞的激活。ELISA结果显示,术后14 d,与WT-Sham组相比,WT-SNI组小鼠脊髓促炎细胞因子TNF-α和IL-6含量均显著升高(P<0.05,P<0.01);与WT-SNI组相比,KO-SNI组小鼠脊髓TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P<0.05,P<0.01),提示AQP4基因敲除可降低小鼠SNI模型脊髓促炎细胞因子水平。结论 AQP4基因敲除可能通过降低脊髓中星形胶质细胞的激活和促炎细胞因子的生成而减轻神经病理性疼痛。

车前子对腹泻大鼠炎性因子和结肠组织AQP4 mRNA和蛋白表达的影响

目的:观察车前子对腹泻大鼠血清中炎性因子和结肠组织水通道蛋白4(AQP4)mRNA和蛋白表达的影响,探讨其治疗腹泻的作用机制。方法:采用番泻叶药液灌胃法复制大鼠腹泻模型。将60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、氢氯噻嗪组(9 mg·kg^-1)和车前子低、中、高剂量组(0.95,1.9,3.8 g·kg^-1)。除正常组外,其余各组均于每日上午灌胃番泻叶药液(20 mL·kg^-1),正常组灌胃等量的蒸馏水;每日下午各治疗组灌服相应药物,正常组和模型组灌服等量蒸馏水,连续14 d。实验结束后,根据粪便性状和大便次数,统计对比各组大鼠的稀便率、平均稀便级和腹泻指数,采集血清和结肠组织标本,检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)和C反应蛋白(CRP)的含量;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠黏膜病理形态学变化;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测结肠组织中AQP4 mRNA和蛋白的表达情况。结果:与正常组比较,模型组稀便率、平均稀便级和腹泻指数显著升高(P<0.01),结肠黏膜表皮细胞出现凋亡坏死,固有层毛细血管扩张充血明显,少量中性粒细胞浸润,血清中TNF-α,IL-6和CRP的含量明显升高(P<0.05,P<0.01),AQP4 mRNA和蛋白的表达均明显下降(P<0.01);与模型组比较,车前子各剂量组大鼠的稀便率、平均稀便级和腹泻指数均显著降低(P<0.01),结肠黏膜表皮细胞凋亡坏死、毛细血管扩张充血和中性粒细胞浸润现象明显改善,血清中TNF-α和CRP的含量降低(P<0.05,P<0.01),AQP4 mRNA和蛋白的表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:车前子具有较好的止泻作用,其机制可能是抑制炎症反应、修复结肠黏膜病理损伤,上调AQP4的表达,调节水液代谢。

归芪白术方联合奥沙利铂通过调节VIP/cAMP/PKA/AQPs信号通路保护胃癌荷瘤小鼠肠道屏障

目的:探讨归芪白术方联合奥沙利铂通过血管活性肠肽(VIP)/环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路调控下游水通道蛋白3(AQP3)和水通道蛋白4(AQP4)从而保护胃癌荷瘤小鼠肠道屏障的作用。方法:将密度为1×10^(7)个/mL的胃癌细胞株MFC制成细胞悬液,经荷瘤小鼠右腋下接种细胞悬液0.2 mL,构建胃癌荷瘤小鼠模型,造模成功后将小鼠随机分为5组,模型组、奥沙利铂组(10mg·kg^(-1))、奥沙利铂加归芪白术方高、中、低剂量组(17.68、8.84、4.42 g·kg^(-1)),每组10只,另外余10只作为空白组。各组小鼠经灌胃或腹腔注射中药、奥沙利铂或生理盐水,治疗14 d。末次给药后,次日眼球取血分离血清并取其结肠样本。苏木素-伊红(HE)染色观察组织形态的变化。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中D-乳酸(D-LA)、二胺氧化酶(DAO)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测各组小鼠结肠组织中VIP、cAMP、PKA、AQP3和AQP4 mRNA及蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组黏膜下层水肿,黏膜层中肠腺排列紊乱,杯状细胞缺失,可见大量炎性细胞浸润及绒毛脱落的现象。而各给药组均有不同程度的改善;与正常组比较,模型组血清中DAO和D-LA水平均显著上升(P<0.01),与模型组比较,联合用药高剂量组DAO和D-LA水平及联合用药中剂量组D-LA水平均有所下降(P<0.05,P<0.01),与奥沙利铂组比较,联合用药高、中剂量组D-LA水平有所下降(P<0.05),其余组DAO和D-LA表达水平也有所下降,但差异无统计学意义;与正常组比较,模型组小鼠的VIP、cAMP、PKA、AQP3和AQP4 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠的VIP、cAMP、PKA、AQP3和AQP4 mRNA及蛋白表达水平均有所升高,其中联合用药高剂量组VIP、cAMP、PKA、AQP3和AQP4 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),联合用药中剂量组cAMP蛋白表达水平升高(P<0.05);与奥沙利铂组比较,联合用药高剂量组cAMP蛋白表达水平明显升高(P<0.05),其余组mRNA及蛋白表达也有所升高,但差异无统计学意义。结论:归芪白术方联合奥沙利铂通过VIP/cAMP/PKA信号通路调节AQP3和AQP4达到保护胃癌荷瘤小鼠肠道屏障的作用。

视神经脊髓炎谱系病患者血清神经丝蛋白轻链水平及其临床相关性分析

目的探讨视神经脊髓炎谱系病(neuromyelitis optica spectrum disorder,NMOSD)患者血清神经丝蛋白轻链(serum neurofilament light chain,sNFL)水平,并分析其与病情轻重的相关性。方法收集2015年7月—2018年12月就诊于蚌埠医学院第一附属医院的NMOSD急性期患者42例作为NMOSD组,同期健康体检者42例作为正常对照组,采用扩展残疾状态量表(EDSS)评估NMOSD组疾病严重程度,以电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)检测sNFL水平,比较NMOSD组与对照组间的sNFL水平,及不同亚型的NMOSD患者sNFL水平,采用简单线性回归方法分析患者sNFL水平与EDSS评分的相关性。结果 NMOSD组sNFL水平[(81.69±35.49)pg/mL]较正常对照组[(16.00±5.61)pg/mL]明显升高,差异具有统计学意义(t’=11.848,P<0.001);AQP4-Ab(+)组sNFL水平[(109.86±31.45)pg/mL]较AQP4-Ab(-)组[(67.61±28.62)pg/mL]明显升高,差异具有统计学意义(t=4.365,P<0.001)。NMOSD组sNFL水平与EDSS分值呈正相关(t=9.108,P<0.001)。结论 NMOSD患者急性期sNFL水平增高,并与疾病严重程度呈正相关。